骨形态发生蛋白7衍生多肽壳聚糖纳米羟基磷灰石胶原复合材料修复骨缺损的实验研究

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1、万方数据中图分类号UDC博士学位论文学校代码!Q533骨形态发生蛋白7衍生多肽庑聚糖／纳米羟基磷灰石肢原复合材料修复骨缺损的实验研究ExperimentalstudyonrepairedbonedefectsbyBMP·-7derived—-peptide／chitosan／nanometerhydroxyapatite／collagenbiomimeticcomposite作者姓名：酆波学科专业：外科学学院(系、所)：卫生部肝胆肠外科研究中心指导教师：胡冬煦教授副指导教师：张阳德教授论文答辩日期兰?圣：?一；答辩委员会主中南大学二O一三年五月万方数据原

2、创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：盟日期：堕年兰月三日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段

3、保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：堑导师签名：鱼生年竺月上日．勿，多年，2目多日‘一t一／o．‘．．一}叫万方数据摘要第一章新型骨形态发生蛋白7衍生多肽对骨髓基质千细胞生物学行为的影响目的：观察采用FMOC／tBu固相多肽合成法人工合成的新型骨形态发生蛋白7衍生多肽对骨髓基质干细胞生物学行为的影响，包括增殖、成骨分化及矿化。方法：骨形态发生蛋白7衍生多肽采用FMOC／tBu固相多肽合成法合成。大鼠骨髓基质干细胞通过原代分离培养获得，并用流式细胞仪鉴定其表面

4、标志物CD90，CD34。将传至第3代的骨髓基质干细胞分为实验组和对照组，在实验组细胞培养基加入终质量浓度为100mg／L的骨形态发生蛋白7衍生多肽，对照组中不添加多肽。经过2，4，6，8，10d时间的培养后，对各组细胞进行MTT检测，评价骨髓基质干细胞的增殖情况；对各组细胞进行7，14，21d的培养后，采用细胞内钙含量法和碱性磷酸酶法评价各组细胞的活性及其成骨分化情况，并通过钙黄绿素染色观察各组细胞的矿化情况。结果：经FMOC／tBu固相多肽合成法和高效液相色谱法可获得纯纯度为97％的骨形态发生蛋白7衍生多肽(KQLNAISVLYFDD)。原代培养大鼠

5、骨髓基质干细胞生长良好，通过流式细胞仪检测其细胞表面标志CD90和CD34，阳性率分别达到91．5％和1．23％。MTT检测结果表明实验组和对照组中的骨髓基质干细胞在中均增殖良好，差异无统计学意义伊>O．05)；经过7d，14d和21d的诱导培养后，实验组骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活性及钙含量显著高于对照组(尸<0．05)，实验组细胞钙黄绿素染色阳性率明显强于对照组。结论：FMOC／tBu固相多肽合成法可以成功合成骨形态发生蛋白7衍生多肽，该活性多肽对骨髓基质干细胞的增殖没有显著影响，但是可以促进骨髓基质干细胞的成骨分化和矿化。关键词：骨髓基质干细胞，生

6、物学行为，骨形态发生蛋白7衍生多肽，成骨分化万方数据第二章骨形态发生蛋白7衍生多肽／壳聚糖／纳米羟基磷灰石／胶原材料的制备及其与骨髓基质干细胞相容性研究目的：制备新型复合材料骨形态发生蛋白7衍生多肽／壳聚糖／纳米羟基磷灰石／胶原，通过体外与骨髓间充质干细胞复合培养，观察其对骨髓间充质干细胞黏附、增殖及分化的影响。方法：采用共沉淀法制备壳聚糖／纳米羟基磷灰石／胶原新型复合支架材料，通过扫描电镜观察该复合支架材料表面的微观形貌；将骨形态发生蛋白7衍生多肽通过真空吸附与支架材料复合，通过高效液相色谱仪检测骨形态发生蛋白7衍生多肽在体外的释放规律；通过将复合骨形

7、态发生蛋白7衍生多肽的支架材料与骨髓间充质干细胞复合培养，以未复合多肽的支架材料作为对照，观察骨髓间充质干细胞在支架材料表面黏附率、增殖、生长以及碱性磷酸酶活性等情况。结果：扫描电镜结果显示新型复合支架材料壳聚糖／纳米羟基磷灰石／胶原支架材料呈多孔状，孔径约为10～lOOp．m不等；该复合支架材料与骨形态发生蛋白7衍生多肽复合后，活性多肽可以从支架材料中缓慢释放，其释放规律为：骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量在第1天时约占总量的(32．5士1．22)％，呈爆发性释放，之后呈缓慢持续释放至14d，其累积释放量约占总量的(64．02+4．21)％；骨髓间充质

8、干细胞在复合多肽的支架材料表面的黏附及成骨分化能力均明显强于对照组(P