靶向neuropilin-单克隆抗体抑制胶质瘤细胞u251对fibronectin的粘附作用及其机制研究

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2、办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文(包括纸质版和电子版)，允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。本学位论文属于：()1．经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于年月(解密后适用上述授权。保密，适用上述授权。(请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委

3、员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。)声明人(签名)：I彩7出厂y口口【肄臼锢摘要研究背景和目的脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤，大多数为浸润性和膨胀性生长，预后相对较差。据美国统计的资料显示，在所有胶质细胞瘤中约占半数的胶质母细胞瘤患者1年生存率约30％，5年生存率不到5％。尽管目前采取最大限度的手术切除及术后放疗与化疗结合等综合治疗，但是恶性胶质瘤(malignantgliomas，MG)的临床预后仍不乐观。目前分子靶向治疗已经成为近年来肿瘤治疗的热点，但是靶向治疗肿瘤的

4、效果仍然十分有限，因此，发现新的肿瘤治疗靶点显得极为重要。人神经菌毛索1(Neuropilin-1，NRP—1)是一种新型的多功能受体，近年来，大量研究结果显示NRP．1可表达于新生血管的内皮细胞和多种肿瘤细胞，并参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。研究表明，NRP．1在胶质瘤的各个发展阶段都有较高的表达，被认为是一个很有希望的治疗新靶点。本文旨在利用本实验室制各的抗NRP一1单克隆抗体针对胶质瘤细胞U251的粘附抑制作用及其机制做进一步的研究。实验方法将杂交瘤细胞腹腔种植于Balb／c鼠、生产抗NRP一1单克隆抗体腹水，抗体

5、用rProteinA亲和柱纯化，利用间接ELISA，Westernblot，流式细胞术和细胞免疫荧光染色对生产的单克隆抗体的特异性和亲和力进行检测。免疫印迹法(Westernb100及细胞免疫荧光检测NRP．1蛋白在胶质瘤细胞株U251的表达。通过粘附实验研究NRP．1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251粘附的影响。通过共聚焦荧光显微镜观察罗丹明一鬼笔环肽染色后NRP．1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251应力纤维的形成的影响。通过免疫共沉淀、westernblot研究NRP一1单克隆抗体对胶质瘤细胞株U251作用后粘附于FN因子上相关

6、蛋白含量的变化。实验结果结果显示，我们制备的抗NRP．1抗体纯化后纯度高达95％，浓度为4mg／ml。WesternBlot实验显示抗体能特异识别胶质瘤U251细胞中的NRP．1蛋白；细胞摘要免疫荧光染色显示NRP一1MAb定位于胶质瘤U251细胞膜上。粘附实验表明抗NRP．1抗体对胶质瘤U251具有粘附抑制的作用。通过共聚焦荧光显微镜、免疫共沉淀、westernblot实验发现，抗NRP．1抗体可以抑制粘附的胶质瘤U251细胞的应力纤维的形成，影响整合素a5B1与NRP．1复合物的形成，降低FAK、pl30cas的磷酸化水平。

7、结论本实验成功制备了高纯度和高特异性的NRP一1MAb；粘附实验结果表明抗NRP．1抗体对胶质瘤细胞U251具有粘附抑制的作用，并且这个作用和抑制NRP一1与整合素Q513l相互结合从而导致FAK／p130cas信号通路受到抑制有关。关键词：Neuropilin．1；抗NRP．1抗体；胶质瘤；细胞粘附IIAbstractBackgroundandPurposeGliomaisthemostcommonprimaryintracranialtumors，mostofwhichweregrowingexpansivelyandinv

8、asively,andtheprognosisisrelativelypoor．U．S．datashowthatamonghalfofallgliompatientswithglioblastoma1-yearsurvivalrateisabout30％．5-y