型超微载体fa-pamam介导htert sirna对人脑胶质瘤细胞u251抑制作用的体外研究

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1、南京医科大学硕士学位论文新型超微载体FA．PAMAM介导hTERTsiRNA对人脑胶质瘤细胞U251抑制作用的体外研究专业：神经外科研究生：李瑞导师：尤永平副教授中文摘要．胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，易复发，难根治。其中恶性胶质瘤约占60％，传统的手术、放疗及化疗等治疗效果欠佳，目前尚无根治的方法。因此明确其发生发展机理，探索有效的治疗方法已成为当今神经外科亟待解决的问题。随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到肿瘤发生的机制主要是由于癌基因的激活和抑癌基因的失活而导致的肿瘤细胞增殖失控、凋亡缺陷以及细胞正常

2、的有限生命周期缺陷，使细胞永生化，继而形成肿瘤。目前国内外研究发现细胞的永生化主要由于在某些因素的作用下激活了细胞内部的端粒酶，进而通过端粒酶来增加端粒序列，稳定端粒长度，从而提高细胞增殖能力并使其永生化。因此，端粒酶的激活可以说是细胞永生化的关键步骤。端粒是指真核细胞线状染色体末端的一段区域，由许多有种属特南京医科大学硕士学位论文异性的简单重复的DNA序列及与其特异性结合的蛋白质构成，它给染色体末端提供一个保护性“帽’’。在人和其它脊椎动物中重复序列为5'-TTAGGG．3’。1984年Greider和Bl

3、ackburn在美国柏克莱的Blackburn的实验室首次从四膜虫细胞提取液中发现有端粒酶的活性。1989年Morin首次在人的癌细胞系Hela细胞中发现了端粒酶。端粒酶是一种核糖核蛋白体(ribonucleoprotein、m＼rP)，由RNA与蛋白质构成的复合体，是一种特殊的反转录RNA依赖性DNA聚合酶，能以自身的RNA为模板，通过逆转录而合成端粒，将端粒重复片段加到染色体的末端。因此它解决了DNA半保留复制模式中末端复制：问题。Counter等1994年首先在转移性卵巢癌病人中检测到端粒酶活性。近几年

4、来各国学者报道了大量有关肿瘤和端粒酶之间关系的文献，结果发现人正常体细胞中除生殖细胞和大多数发育中胚胎细胞及有增殖能力的更新组织中有较高的端粒酶活性外，大多数端粒酶阴性，通过对5000例以上的肿瘤标本进行端粒酶活性的检测发现，其中约85％为阳性，90％vX上的恶性肿瘤中端粒酶阳性，且端粒酶的活性随着肿瘤恶性程度的增高而增高。人端粒酶包括自RNA(humantelomeraseRNA，hTR)、催化亚基(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)和相关蛋白1(telom

5、eraseassociatedprotein1,TP1)。hTERT属于逆转录酶(reversetranscriptase，Im家属成员，是一个有约40kb；k．小的单拷贝基因，定位于5p15．33。催化亚基基因首先是工endvay在酵母中发现。1997年编码hTERT的基因被克隆出来。hTERT启动子序列于1999年被克隆出，南京医科大学硕士学位论文有1．7Kb长，其中有251bp(一211~+40)是核心部分。近年来的研究发现hTERTmRNA除在胸腺、睾丸、小肠等几种正常组织中有低水平表达外，在大多数正

6、常组织(心、脑、乳腺、肝、骨骼肌、前列腺、胎盘、卵巢)中都没有检测到。但对各种肿瘤组织的检测发现，hTERTmRNA在大多数肿瘤组织中表达，在所有的端粒酶阳性的肿瘤组织中都可检浈,]多IhTERTmRNA。在对脑肿瘤hTERTmRNA的研究中发现：hTERTmRNA在胶质瘤细胞中存在高表达，hTERTmRNA和hTERT蛋白表达水平与胶质瘤的恶性程度密切相关，且随着肿瘤的恶性度增加而升高，而正常脑组织中则没有hTERT的表达。lfl前认为hTERT是端粒酶的催化蛋白组分，同时也是端粒酶活化和细胞癌变的限速步骤

7、，抑制其表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长和诱导凋亡，可作为胶质瘤基因治疗的理想靶标。当前针对胶质瘤的基因治疗方案主要包括免疫增强治疗、基因介导的酶前体药物治疗，抑癌基因替代治疗和反义治疗等。这些方法主要是通过将外源性目的基因导入宿主靶细胞内，使之表达以纠正细胞基因缺陷，达到疾病治疗目的。随着分子生物学技术的发展，基因治疗的技术不断得到优化和改进。近年来研究发现，一些小的双链RNA(double—strandedRNA，dsRNA)可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使其mRNA降解，诱使细胞出现特定基因缺

8、失的表型，这种技术即时蛆干扰(RNAinterference，RNAi)，属于转录后基因沉默(post-transcrptionalgenesilencing，PTGS)。RNAit&象广泛存在于大多数真核细胞中，在南京医科大学硕士学位论文小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也可以成功阻断基因的表达，实现细胞水平的基因敲除。基因治疗成功与否的关键在于采用理想的载体将靶基因高效地转导入靶细胞并获得