补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞bmp-15及其smads信号通路影响的研究

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1、目录IIIIIIIIIIIIIIIIIIlY2337080中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5英文缩写⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．10研究论文补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP．15及其Smads信号通路影响的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．12材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13

2、结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一20附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一26附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44结j沧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55综述骨形态发生蛋白．15的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．60致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．69个人简历⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70中文摘要补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP．15及其Smads信号通路影晌的研究摘要目的：本课题组前期实验结果已证实，补肾调经方、逍遥丸均可提高IVF—ET控制性促排卵患者的临床妊娠率，并增加卵泡液中BMP．15的蛋白含量和颗粒细胞中BMP．15mRNA的表达，提示补肾调经方、逍遥丸促进卵泡发育、改善卵子质量的作用可能与其调控卵母细胞分泌因子BMP一15的分泌有关。BMP．15与细胞膜上BMPRII和ALK6结合激活Smadl／5／8进行信号转导，BMP．15及其

4、Smads信号通路对卵泡发生发育、卵丘扩散、卵母细胞的成熟起着重要作用。本研究将补肾调经方、逍遥丸作为补肾法、疏肝法的代表方剂。在前期研究基础上，通过动物实验进一步探讨补肾法、疏肝法提高小鼠卵母细胞质量与调控BMP一15及其Smads信号通路的关系，比较两法的作用机制和环节有何异同。为中医药作为IVF—ET控制性促排卵的辅助用药提供实验依据。方法：选用6．7周龄健康雌性昆明小鼠900只，分6批进行实验，每批150只，随机分为6组：疏肝低剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、补肾高剂量组、空白对照组和COH

5、组，每组25只(6批每组合计150只)。实验用逍遥丸为河南宛西制药股份有限公司生产，将200、100丸逍遥丸溶于125ml蒸馏水中制成混悬液，高剂量含生药0．69／ml，低剂量含生药o．3∥m1；补肾调经方所需药材一次性购自石家庄市乐仁堂药店，并由本校中药系制成口服液，高剂量含生药5．49／ml，低剂量含生药2．79／ml，置4℃冰箱中备用(高、低剂量相当于临床用量的20、10倍)。疏肝低、高剂量组(逍遥丸配合PMSG)、补肾低、高剂量组(补肾调经方配合PMSG)和COH组(PMSG)，分别用逍遥丸、补

6、肾调经方和蒸馏水灌胃，1ml／1009体重，连续lO天。各治疗组及COH组于第11日同时腹腔注射PMSG10IU／只，48h后腹腔注射HCG10IUl只。空白对照组每日阴道涂片，观察动情周期。第一批小鼠于注射HCGl6h后，疏肝低、高剂量组、补肾低、高剂量组和COH组各取15只小鼠；空白对照组于阴道涂片见大量角化上皮中文摘要细胞次日，取15只小鼠，均脱颈椎处死，取出双侧输卵管，置于灭菌培养皿中。在体视镜下用lml注射器针头划破输卵管壶腹部，收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)，迅速检查并记录排卵数和优质卵

7、泡数。然后用0．05％的透明质酸酶消化掉卵丘颗粒细胞，再用PBS反复冲洗，以获得MII期卵母细胞。迅速将其置于冰上，用于实时荧光定量PCR。各组剩余10只小鼠的MII期卵母细胞获取方法同上，将其置于．80℃保存备用(用于Westernblot)。第二批小鼠于注射HCG同时，将疏肝低、高剂量组、补肾低、高剂量组和COH组各取20只小鼠；空白对照组于阴道涂片见到大量角化上皮细胞时，取20只小鼠，与8-9周龄雄性昆明小鼠按1：1比例合笼，观察各组的妊娠率。各组剩余5只小鼠的MII期卵母细胞获取方法同上，将其放

8、入4％的多聚甲醛中固定(用于免疫组化)。第三批至第六批小鼠的MII期卵母细胞获取方法同上，将一部分放入4％的多聚甲醛中固定(用于免疫组化)，另一部分置于．80。C保存备用(用于Westernblot)。采用Westernblot、免疫组化法检测卵母细胞中BMP．15、BMPRII、ALK6、Smadl、Smad5、Smad8蛋白的表达；采用实时荧光定量PCR检测上述指标mRNA的表达。结果：l疏肝低、高剂量组和补肾低、高剂量组小鼠排卵数、优