肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统的研究

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1、南方医科大学2007级博士学位论文肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统的研究StudyontumortargetedACPPs--HPMApolymer-adenovirusanti--cancerconjugates课题来源：广东省国际合作项目(20108050700023)广州市属高校科研项目(10A151)学位申请人李书华导师姓名张雅洁教授专业名称病理学与病理生理学培养类型学术型培养层次博士研究生所在学院基础医学院2013年5月15日广州博士学位论文肿瘤靶向腺病毒高分子给药系统的研究博士研究生：李书华指导教师：张雅洁教授摘要研究背景和目的腺病毒(Adenovirus)具有宿主广泛

2、、繁殖滴度高、不整合，对静止细胞也能感染及相对完全等特点，因而被广泛用于肿瘤基因治疗。但是，人群中普遍存在腺病毒中和抗体，不利于病毒载体的重复给药，制约了它在临床上的应用。此外，腺病毒对肿瘤的靶向性不足，使得感染肿瘤细胞的病毒量大大减少，减弱了杀伤肿瘤细胞的作用，增加了可能的机体毒副作用。因此，如何降低腺病毒载体的免疫原性，提高其肿瘤靶向性，成为基于腺病毒载体的肿瘤基因治疗亟需解决的问题。当前，降低腺病毒载体免疫原性的策略主要有以下两个方面：改造腺病毒载体和免疫调控。但目前这两种方法均系抗腺病毒免疫的优化方案，未能屏蔽腺病毒免疫原性，因而免疫系统仍然对腺病毒进行免疫识别与免疫清

3、除。以腺病毒载体外壳蛋白修饰和基因复制与表达调控为主的增强腺病毒肿瘤靶向性的策略虽然取得了进展，但无法同时解决腺病毒的免疫原性的问题。因此如何将这些改造策略有机地结合起来，以便实现多种策略协同作用，最大限度的发挥腺病毒载体作用的同时，保证它在临床应用中的安全性，将是未来研究的重点。pHPMA是在肿瘤、骨骼及炎症等研究领域最受关注的高分子给药系统，具有生物相容性、非免疫原性、无毒性的特点，与药物接合后可以延长药物血液循环半衰期及实体瘤趋向性给药，目前通过应用pHPMA给药系统，以阿霉素为代表的多个药物已用于临床研究。近年来，Fisher等首先发现腺病毒通过pHPMA进行给药时发生

4、免疫逃逸，证实TpHPMA可消除机体免疫系统对腺病毒的免疫摘要识别与免疫攻击。Vladimir等在其后的研究发现pHPMA．腺病毒接合物可选择性沉积于肿瘤组织，证明]'pHPMA．腺病毒接合物肿瘤靶向性给药的特点。因而，pHPMA被认为是腺病毒治疗的最佳给药系统，对提高腺病毒肿瘤靶向性，降低其免疫原性及毒副作用具有重要意义。pHPMA给药系统细胞吸收的主要障碍是细胞膜屏障，仅能通过胞吞或胞饮分布于质膜和溶酶体，难以在胞浆和胞核发挥作用，药物分子的治疗效果因而下降。目前研究的方向是开发靶向性活性分子修饰pHPMA载体的腺病毒给药系统，使pHPMA给药系统突破细胞膜屏障进入细胞浆或

5、细胞核，提高药物的治疗效果。pHPMA的靶向分子修饰是利用靶向活性分子改变pHPMA作为大分子吸收慢而导致的腺病毒在体内活性降低的问题，使pHPMA的被动吸收变为主动运输，提高药物的内吞速度，实现药物的可控释放。目前常用的靶向分子如配体和单抗等存在与受体作用时间长的问题，导致腺病毒在体内的循环时间延长。现在通常将穿膜作用最强的穿膜肽作为活性分子以改变pHPMA一腺病毒给药系统的跨膜转运问题。但细胞穿膜肽缺乏靶向性，如能改造细胞穿膜肽的嗜性，使之在肿瘤组织进行可控释放，则可在加速pHPMA一腺病毒给药系统跨膜转运的同时，实现肿瘤的靶向性治疗，使腺病毒达到最大程度的抗肿瘤治疗效应。

6、但用肿瘤靶向性细胞穿膜肽修饰pHPMA一腺病毒给药系统的研究尚未见相关报道。本研究拟设计合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽对pHPMA一腺病毒给药系统进行修饰，以期在增强穿膜效率的同时，进一步增强其主动靶向性，提高腺病毒生物治疗效应。通过基因克隆技术，我们构建了广谱抗肿瘤腺病毒Ad．mda．7．egfp，通过化学合成的方法分别设计合成了高分子载体pHPMA及肿瘤靶向分子：可活化细胞穿膜肽(activatablecell—penetratingpeptide，ACPPs)，通过化学修饰的方法合成了ACPPs．pHPMA—Ad给药系统，对该系统的给药特点进行了分析与鉴定。成功构建的ACPPs

7、．pHPMA．Ad．mda．7．egfp给药系统，不仅实现了腺病毒的免疫逃逸，同时加速了pHPMA．Ad．mda．7．egfp在靶细胞摄取，提高了pHPMA．Ad．II博士学位论文mda-7．egfp肿瘤靶向性。因ACPPs的肿瘤靶向性设计是基于多种肿瘤细胞过表达基质金属蛋白酶的特性，故ACPPs-pHPMA—Ad．mda-7．egfp给药系统有望应用于多种肿瘤的临床分子诊断与治疗。方法1．抗肿瘤腺病毒Ad．mda一7．egfp的构建与鉴定选择靶向性诱导肿瘤细胞凋亡的广谱抗肿瘤基因黑色素瘤分