绵羊yap1基因与肌肉生长相关基因表达相关分析以及载体构建的研究

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1、论文资助项目l、中国博士后科学基金特别资助项目“中外绵羊品种肌肉生长发育3个侯选基因表达及其对肉质指标影响的比较研究”(200902154)2、江苏省农业科技支撑计划项圈“优质肉用湖羊新品系选育”(BE2012331)3、江苏省工程技术研究中心项目“江苏省肉羊集约化健康养殖工程技术研究中心’’(BM2012308)4、科技部家养动物种质资源平台运行项目(201卜2013)5、江苏省高校优势学科建设工程资助项目绵羊YAPl基因与肌肉生长相关基因表达相关分析以及载体构建的研究IIIIIIIIIlUlllll

2、lllllllllllllllllllll．1lllU．1研究生：李达Y2419砷1导师：孙伟副教授专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)摘要本实验以湖羊为研究对象，利用基因克隆技术克隆绵羊YAPl基因eDNA全长序列，并利用生物学分析软件对绵羊YAPl基因与其他物种的同源性，其蛋白的理化性质，二级结构和三级结构进行了生物信息学分析；利用荧光定量PCR技术对绵羊YAPl基因在出生后二日龄，二月龄和六月龄不同公母在四种不同骨骼肌(背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌)的相

3、对表达进行了分析；并利用RT-PCR、载体构建和定点突变技术，构建了pEGFP．C1．YAP1，及其磷酸化位点突变体pEGFP．C1．YAPl$42A真核表达载体。旨在探索YAPl在绵羊出生前和出生后肌肉生长过程中的调控机制，为湖羊肌肉生长性状的选育提供遗传学资料。本研究获得了一下结果：1．克隆获得绵羊YAPl基因序列全长为1712bp，其中包括编码区1212bp，57UTR27bp和3UTR473bp，共编码403个氨基酸。同源性分析发现，绵羊YAPl核苷酸序列与推测的氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高，

4、分别达到78．77％和92．51％，而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析得到，绵羊YAPl基因编码蛋白为水溶性蛋白，相对分子量为44079．0Da，理论等电点为4．91，无信号肽序列和跨膜区；亚细胞定位主要在细胞核，不属于分泌蛋白；预测含有33个磷酸化位点，7个糖基化位点，具有两个WW结构域，二级结构以无规则卷曲为主，三级结构显示，YAPl结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAPl蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。2．绵羊YAPl基因在不同肌肉中的表达存在显著差异，其中在腓肠肌中相对表达最高

5、，在背最长肌中最低，在不同生长阶段(二日龄、二月龄和六月龄)的比较中，YAPl的表达随月龄的增加而升高。YAPl在公母间表达的差异不显著。YAPl与肌球蛋白重链(MyHCI、IIA、IIX)、MSTN、MyoG的表达关联性分析表明，YAPl与MyHCI呈极显著负相关，与MyHCIIX、MSTN、MyoG呈极显著正相关，揭示YAPl与出生后肌纤维的发育有关联，可能参与了肌球蛋白重链基因的相互转化，并可能成为调节肌肉生长的候选基因。3．重组质粒pEGFP—C1-YAP1经PCR、酶切、测序鉴定，证实YAP1

6、基因CDS区已正确克隆入pEGFP—C1表达载体；经测序鉴定，YAPl第42位丝氨酸成功突变为丙氨酸。本研究为探索YAPl在成肌细胞增殖和分化过程中的调节机制奠定了实验基础。关键词：肌肉：YAPl；基因克隆；表达；载体构建IIResearchonexpressioncorrelationanalysisbetweensheepYAP1andothergenesrelatedwithmusclegrowthandtheconstructionofYAP1eukaryoticexpressionvector

7、M．S．Candidate：LiDaSupervisorProf．"SunWei(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,225009)AbstractInthisexperiment，Husheepwasresearchedastheobject，genecloningmethodWasusedtoclonefull—lengtheDNAsequenceofsheepYAP1andbiologicalanalysissoftware

8、WaSusedtoanalyzetheYAP1sequencehomologybetweensheepandotherspecies，physicochemicalproperties，secondaryandtertiarystructure；RT-PCR、vectorconstructionandsite-directedmutagenesismethodswereusedtoconstructpEGFP—C1-YAP1andpEGFP