靶向急性髓系白血病干细胞抗cd123单克隆抗体制备及功能试验

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1、华中科技大学博士学位论文靶向急性髓系白血病干细胞的抗CD123单克隆抗体的制备及功能试验摘要【目的】急性髓系白血病作为一种高度异质性的疾病，诱导失败和耐药复发是其治疗失败的主要原因。而白血病干细胞是急性髓系白血病发生、耐药和复发的根源，针对白血病干细胞的靶向治疗更有可能根治白血病。IL-3受体介导的信号传递是促进急性髓系白血病细胞增殖的原因之一；IL-3受体α链/CD123更是急性髓系白血病干细胞的标志之一，而正常造血干细胞表面表达水平低下。因此，制备能靶向杀伤白血病干细胞的抗CD123的单克隆拮抗抗体，可能具有潜在的治疗价值。【方法】第一部分：克隆IL3RA胞外区与人IgGFc重组，构

2、建两种真核表达载体，即pG4Fc-3.3-hIL3RASP+ECD和pYD11-hIL3RAECD，瞬时转染HEK-293F细胞，选择表达效率最佳的载体表达、纯化并鉴定IL3RAECD/Fc融合蛋白，作为免疫原。同时，我们定向克隆IL3RA编码区构建另外两种真核表达载体，即hIL3RACDS-pEGFP-N1和pcDNA3.1(+)-IL3RACDS，前者用于制备稳定表达CD123的细胞株以供后续检测和筛选抗体，后者将作为另一种免疫方式免疫小鼠；为克服质粒免疫动物后血清抗体效价低的缺点，我们还重组包装了能表达CD123的腺病毒Ad-IL3RA，供质粒免疫后的加强免疫使用。第二部分：利用前

3、面构建的真核表达载体hIL3RACDS-pEGFP-N1脂质体转染CHO细胞，经过流式分选、G418筛选和流式、Elisa和Westernblot鉴定CD123的表达水平，获得能稳定高表达CD123的细胞株，供制备抗体时筛选抗体用。同时，以IL3RAECD/Fc融合蛋白、表达IL3RA的急性红白血病TF-1细胞株和前述构建的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL3RACDS质粒三种方式进行免疫，Elisa筛选血清抗体效价高的Balb/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经过Elisa和间接流式1华中科技大学博士学位论文挑选阳性孔，再进行数轮有限稀释和筛选，挑选出能分泌

4、抗CD123单克隆抗体的杂交瘤细胞株，供后续功能试验用。第三部分：建立IL-3增殖拮抗实验和急性白血病免疫缺陷NOD/SCID小鼠异种移植模型，分别检测这11株抗体竞争性拮抗IL-3/IL3RA交联及IL-3的促增殖效应，介导+-+ADCC效应抑制白血病CD34CD38细胞归巢和CD45细胞植入，降低肿瘤负荷并延长生存期的靶向治疗效应。【结果】除利用TF-1细胞免疫未能获得抗体以外，我们利用制备的重组蛋白和质粒两种抗原免疫，各获得了3株和8株能分泌抗CD123抗体的杂交瘤细胞株，并经Elisa和间接流式证实杂交瘤株所分泌抗体与IL3RAECD/Fc融合蛋白、TF-1和8G9细胞表面CD1

5、23的亲和力，且质粒免疫获得的1株抗体在后续的IL-3增殖拮抗实验中被证实能阻断细胞膜表面IL-3/IL3RA的交联以及IL-3的促增殖效应，表明是一株拮抗抗体。为进一步验证治疗性抗体抗肿瘤功能，还建立并验证了急性白血病免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型。【结论】利用质粒免疫、腺病毒加强的方式制备抗体效率最高，更易获得有功能的治疗性抗体。共获得11株能分泌抗CD123单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过IL-3增殖拮抗实验，从中筛选出1株能竞争性拮抗IL-3/IL3RA的交联及IL-3的促增殖效应的拮抗抗体+-5A2，尚需利用建立的模型验证5A2是否介导ADCC效应，抑制白血病CD34CD38+

6、细胞归巢和CD45细胞植入，降低肿瘤负荷并延长生存期。【关键词】急性髓系白血病、靶向治疗、单克隆抗体、CD1232华中科技大学博士学位论文GenerationandFunctionalAssaysofAcuteMyeloidLeukemicStemCellsTargetedAnti-CD123MonoclonalAntibodyABSTRACTObjective:Acutemyeloidleukemia(AML)isaheterogeneousdisease,treatmentfailureandrelapseisthemajorcauseforpoorprognosis.Leukemi

7、cstemcells(LSCs)istheoriginofdiseasepersistence,drugresistanceandrelapse,sotheLSCstargetedtherapymaypresentasacurabletreatmentforAML.Thesignaltransductiondrivedfrominterleukin-3receptorinvolvedinthestimulationofprolife