白念珠菌新型耐药基因mxr1面朝药机制的研究

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1、第二军医大学博士学位论文白念珠菌新型耐药基因MXRl耐药机制的研究Studyonfunctionsofdrug·-resistance--relatedgeneMXRlinCandidaalbicans二。一三年五月IIIIIilll1111IIIIIIIILIIIIIIlllllIY2339921独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担

2、本声明的法律责任。学位论文作者签名：萝聋f象硒日期：加以年舌月?口日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：专零谚I

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4、9日期：沙f3年b月弓。日导师签名：日期：汕／

5、3年6月3。日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一部分MXRl基因敲除质粒的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22第二部分MXRl基因敲除菌的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38三、

6、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42第三部分MXRl基因缺失菌对抗真菌药物敏感性的影响⋯．．．44一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48第四部分MXRl基因对白念珠菌氧化应激等耐药机制影响⋯49一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69总结⋯⋯．．

7、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯71参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯76在读期间发表论文和参加科研工作情况说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯86白念珠菌新型耐药基因MXRl耐药机制的研究事两要白念珠菌由于具有高适应性和高耐药性，因此易于感染而难以防治。近年来，国际上有大量关于白念珠菌适应氧化应激机制的研究，并有大量文献提示，白念珠菌氧化应激机制可能与其对唑类药物的耐药性有关。因此，白念珠菌氧化应激

8、对于全面阐述其耐药机制有着十分重要的意义。研究目的通过基因敲除的方法，构建MXRl基因缺失菌株，从而研究MXRl基因缺失后对菌株生长、药物敏感性、对H202的耐受能力、细胞内活性氧、谷胱甘肽还原体系、线粒体膜电位、氧化应激相关基因表达、CDRl等重要的耐药基因表达、菌丝形成、罗丹明外排及渗透敏感性的变化。研究方法1．构建基因敲除载体质粒：利用PCR、双酶切及DNA连接法，构建MXRl基因敲除载体质粒，该质粒是以p5921质粒为基础，含有MXRl基因ORF两侧的上下游片段及hisG．Ura3．HisG片段。构建后分别采用PCR、双酶切

9、和测序鉴定法，鉴定每一步的阳性质粒。2．构建基因缺失菌：通过URA．Blaster法构建MXRl基因缺失菌株，每一步采用PCR鉴定，最后的阳性菌株采用Southern．blot鉴定。3．生长曲线：将野生菌与MXRl基因缺失菌株，等浓度培养，在不同的时间点测量各菌株的OD600值，从而得到各株菌的生长曲线。4．MXRl基因缺失菌对药物敏感性的实验：通过MIC80和Spot．assay实验，研究MXRl基因缺失菌对药物敏感性的变化。5．MXRl基因缺失菌对H202耐药力的实验：通过H202液基摇培实验、Spot．assay实验，研究MX

10、Rl基因缺失菌对H202耐药力的变化。6．细胞内活性氧——ROS含量的测定：将2，7．二氢二氯荧光素二乙酯——DCFH．DA与菌株共培养，在不同时间测定荧光值，从而测定细胞内活性氧(ROS)的含量。7．氧化型和还原型谷胱甘肽含量测定：