中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究

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1、中国青岛文吕鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究中国青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的研究专业：生物化学与分子生物学硕士生：桂晶春指导老师：徐安龙摘要本文综合应用现代分子生物学方法与技术，从核酸水平和蛋白质水平，对我国海洋珍稀物种青岛文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子(Bbt-MIF)进行较为系统的研究。以期阐明巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)在免疫系统进化过程中和其它生命活动中的重要性和特殊性，为进一步认识巨噬细胞迁移抑制因子的分子进化和适应性免疫起源提供直接的实验证据支持。通过对青岛文晶鱼卵巢cDNA表达文库的序列测定和生物信息学分析，获得了

2、两个编码文昌鱼巨噬细胞迁移抑制因子的全长cDNA序列。这两个全长cDNA序列尽管都编码巨噬细胞迁移抑制因子，但是其cDNA序列长度却相差甚远。为探究该基因在文昌鱼基因组中的存在方式和结构形式，对文昌鱼基因组进行了Southernblot和PCR扩增、测序分析。实验结果证明MIF在文昌鱼基因组中以多拷贝的形式存在，MIF基因中含两个内含予，不同拷贝之间的内含子序列不同。目前关于MIF基因的报道中，人们发现仅在低等无脊椎动物中存在多拷贝的形式，在哺乳动物及其他脊椎动物中都是以单拷贝的形式存在。鉴于MIF在天然免疫系统中的重要作用，

3、作为从无脊椎动物到脊椎动物过渡类型的文昌鱼，其MIF的存在形式对认识免疫系统的进化具有重要参考价值。以Bbt．MIF的全长cDNA中的特异序列为引物，不同组织部位(消化道、鳃、精巢、卵巢，脊索，肌肉)的总cDNA一链为模板，做RT-PCR反应检测MIF的转录模式。RT-PCR结果显示MIF在卵巢和脊索中高表达，僵是在精巢中末检测到M球的转录。MIF在卵巢和脊索中的高表达可能与这些组织部位的免疫调节和控制细胞的生长发育有关，但是精巢中为何不表达MIF的原因有待进一步探索。以pET21b做原核表达载体，成功实现了Bbt．MIF—I

4、l在大肠杆菌BL21(DE3)中的高表达。进一步通过阴离子亲和层析、疏水层析、分子筛层析等纯化方法获得了高纯中国青岛文吕鱼巨噬细胞迁移抑制训子的研究度的Bbt-MIF-II成熟重组蛋白。对重组蛋白Bbt．MIF．II进行酶学活性检测发现，Bbt—MIF-II有较强的拓扑异构酶活性和氧化还原酶活性。与哺乳动物MIF的氧化还原酶活性相反，文昌鱼MIF不能希j用GSH做还原剂还原胰岛素，却能利用DTT做还原剂将胰岛素还原。尽管目前还不完全清楚MIF生理条件下的活性底物，哺乳动物MIF和文昌鱼MIF在体外氧化还原酶活性测定中对还原剂选

5、择性的差异可能也反应了二者在生理条件下功能上的差异。总之，对文昌鱼MIF的序列分析及基因结构、转录模式和酶学活性的研究，为进一步研究其结构与功能关系及免疫调节机制进化打下了基础。实验结果充分显示了MIF在生物进化过程中的重要性、特殊性和活跃性，为我们迸一步认识免疫系统的进化，尤其是在从无脊椎动物到脊椎动物这一具有重大意义的转变过程中免疫系统的进化提供了新的视野。关键词青岛文昌鱼：巨噬细胞迁移抑制因子：基因结构：转录模式；酶学活性II!里要些兰墨鱼曼堕塑些堑整塑型望王塑型塞Studyonmacrophagemigrationin

6、hibitoryfactorfromChineseamphioxus，BranchiostomabelchedtsingtauneseMajor：biochemistryandmolecularbiologyName：JingchunDuSupervisor：AnlongXuAbstractAcomprehensivestudywascarriedoutonthemacrophagemigrationinhibitoryfactorofChineseamphioxus，Branchiostomabelcheritsingtau

7、nese，atthelevelofDNAandprotein，usingmethodsofmolecularbiology．TheaimistounderstandtheimportanceandspecialityofMIFduringthecourseofimmunesystemevolutionandotherbiologicalactivity．TheresultsprovidedirectproofforfurtherunderstandingthemolecularevolutionofMIFandtheorigi

8、nofinnateandadaptiveimmunity．TwofulllengtheDNAsequencesencodingmacrophagemigrationinhibitoryfactorwasobtainedfromeDNAexpressionlibraryofCh