溶瘤腺病毒sg655-mgmp对肿瘤干细胞的治疗作用研究

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1、第二军医大学事it'-az掌位论文溶瘤腺病毒SG655．mGMP对肿瘤干细胞的治疗作用研究ThetherapeuticeffectofoncolyticadenovirusSG655一mGMPoncancerstemcells学科和专业：肿瘤学研究生：吕赛群导师：钱其军教授培养单位：第二军医大学东方肝胆外科医院独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示

2、谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：马疆君淬日期：妒1；年6月；日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。学位论文作者签名：昌熙厨日期：伽I哆年6月弓日导师签名：日目录缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯一6．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8．fjU吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-8一第一章溶瘤腺病毒SG655．mGMP及相关对照病毒的构建与制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．19．一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19．(一)实验所需材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19一(二)实验所需试剂的配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22．(三)溶瘤腺病毒穿梭质粒P74．Tp—mGM—CSF的构建．．．

4、24．(四)溶瘤腺病毒的重组鉴定、扩增及纯化⋯⋯⋯⋯⋯．37．二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一49．(一)质粒P74．Tp．mGM—CSF的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯．．．49．(二)溶瘤腺病毒SG655．mGMP及SG655．mGMPC的PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53．(三)WesternBlotting检测2个腺病毒在细胞中P53表达⋯．60．(四)ELISA方法检测2个腺病毒中mGM．CSF蛋白表达⋯．61．(五)溶瘤腺病毒的扩增纯化与滴度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯一63一三、

5、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．j⋯⋯一63．第二章溶瘤腺病毒SG655．mG御对肿瘤干细胞的体外作用研究．．．．．．．．．．．。．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．。．．．。．．．．．．．．．．．．。．．。．．．．．．．．．．．．．．．。。．．．。．．．。．．．．．．．．．。．．．．．，，。．．。．。．．．。．．．65．．一、材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一65．(一)实验所需材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一65．(二)实验所需试剂的配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．67一(三)实验方

6、法步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．69．二、实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一73．(一)、荧光显微镜观察溶瘤腺病毒SG7605一EGFP及SG7605—11R。EGFP对肿瘤干细胞的感染效率⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．73．(二)、流式细胞仪检测溶瘤腺病毒SG7605．EGFP及SG7605。l1R-EGFP对肝癌干细胞Hep3B—C的感染效率⋯⋯一74．(三)、WesternBlotting方法检测溶瘤腺病毒在肿瘤干细胞中P53蛋白表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一75．(四)、ELISA实验检测溶瘤腺病毒S

7、G655一mGMP在小鼠畸胎瘤干细胞中mGM．CSF蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一76一(五)、CCK．8实验检测溶瘤腺病毒对肿瘤干细胞的生长抑制作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．77．(六)、流式细胞仪检测溶瘤腺病毒SG655．mGMP对Hep3B．C细胞的促凋亡作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．78一三、讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-79-第三章溶瘤腺病毒SG655．mGMP对畸胎瘤干细胞的体内作用研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯¨．80一一、实验材料与方法⋯⋯

8、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．80一(一)实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一80．(二)实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．二、实验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．85．(一)、C57BL／6小鼠畸胎瘤干细胞