NLRP3炎症小体在高尿酸诱导心肌细胞损伤中的作用研究

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1、单位代码10475学号104753130972分类号R34硕士学位论文NLRP3炎症小体在高尿酸诱导心肌细胞损伤中的作用研究学科、专业：生物学、细胞生物学研究方向：细胞凋亡及信号转导申请学位类别：理学硕士申请人：王冠丽导师：张军教授张海龙副教授二〇一七年六月THEROLEOFNLRP3INFLAMMASOMEINMYOCARDIALCELLINJURYINDUCEDBYHYPERURICEMIAADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartial

2、FulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByGuanliWangSupervisorProf.JunZhangAssociateProf.HailongZhangJUN2017摘要摘要背景高尿酸血症是由于体内尿酸含量过高，导致血液中的尿酸盐以结晶的形式沉积于人体的组织和器官上，引起各种相关性疾病，如痛风、心肌病、肾病、高血压、代谢综合征等。在这些相关疾病中，高尿酸导致的心肌病对人体造成的伤害越来越受到重视。高尿酸可以通过多种途径诱发心脏疾病，如抑制一氧化

3、氮（NO）的产生、促进血小板聚集、促进氧自由基的增加以及形成尿酸盐结晶等，然而高尿酸血症造成心肌损伤的确切机制仍不清楚。有研究提出炎症在心脏疾病造成的心肌损伤中发挥着重要作用，而尿酸盐晶体（MSU）可以激活炎症小体诱导炎症的发生。但是，当尿酸达到一定浓度还未形成结晶时，这种高浓度的可溶性尿酸是否与尿酸结晶激活炎症小体的通路相似，具体是通过哪条通路来激活NLRP3炎症小体还不清楚。以及NLRP3炎症小体在其中扮演着怎样的角色，这些问题均需要进一步的研究，一些相关检测可能为高尿酸血症造成的心肌损伤提供指示作用，从而为预防和治疗高尿

4、酸血症相关的心脏疾病提供一定的理论依据。目的建立高尿酸心肌细胞模型；研究可溶性高尿酸引发心肌损伤的具体机制以及NLRP3炎症小体在其中发挥的作用，同时探索炎症小体活化时Toll样受体、线粒体损伤和ROS在其中的作用。方法将实验设计为5个处理组（Normal、UA-50mg/L、UA-100mg/L、UA-200mg/L、UA-400mg/L），3个时间点（12h、24h、48h）。收取细胞培养上清，利用乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞受损情况；使用MTS法进行细胞活力检测；流式细胞术检测尿酸处理后细胞凋亡情况；实时定量荧光聚合酶链

5、式反应INLRP3炎症小体在高尿酸诱导心细胞损伤中的作用研究（RT-PCR）检测ASC、Caspase-1以及IL-1β的基因表达水平；WesternBlot检测不同浓度尿酸处理后ASC、Caspase-1以及NLRP3的蛋白表达水平；通过线粒体分离实验，WesternBlot检测细胞色素C的变化；流式细胞术检测不同浓度尿酸处理24小时后，ROS释放情况；加入ROS清除剂NAC后，以DMSO为对照组，流式细胞术检测ROS释放情况；WesternBlot检测加入NAC后相关炎症因子NLRP3、Caspase-1以及ASC的蛋白表

6、达变化；LDH法检测加入ROS清除剂NAC后细胞损伤情况；WesternBlot检测不同浓度尿酸处理H9C2心肌细胞24h后，UCP2的蛋白含量；免疫荧光技术验证不同浓度尿酸处理H9C2心肌细胞后，UCP2的蛋白表达；实时定量荧光聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Toll样受体1-9的基因含量变化；WesternBlot检测TLR6的蛋白表达；WesternBlot检测NF-κB信号通路相关因子（磷酸化的p65和IKKα/β）、JNK信号通路相关因子（磷酸化的TAK1和JNK）、P38信号通路相关因子（磷酸化的MKK3/6和p

7、38）的蛋白表达变化；WesternBlot检测三种干扰RNA对TLR6的干扰效果；免疫荧光验证siRNA3的干扰效果；WesternBlot检测干扰TLR6后炎症小体相关因子NLRP3以及NF-κB信号通路相关因子（磷酸化的p65）的蛋白表达；LDH检测干扰TLR6后细胞损伤情况；RT-PCR检测干扰TLR6后IL-1β的基因表达；免疫荧光检测干扰TLR6后细胞内IL-1β的表达水平；WesternBlot检测干扰TLR6后分泌到细胞上清中IL-1β的蛋白表达含量。结果首先用不同浓度的尿酸处理心肌细胞，高尿酸心肌细胞模型建立

8、成功。MTS结果显示，随着尿酸浓度的增加和处理时间的延长，细胞活力有明显降低，并且在尿酸浓度为200mg/L时开始有统计学差异；LDH结果显示，与正常组细胞相比，处理组细胞LDH含量呈剂量依赖性升高，细胞受损程度明显增加；RT-PCR和WesternBlot分别检测出NLRP