nlrp3炎症小体在热应激损伤中的作用研究-药学专业毕业论文

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1、一、细胞实验．．．47．二、动物实验．．50．讨论．．54．第三部分NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究．．56一材料和方法．．．56一一、实验材料．．。56一二、实验方法及操作．．57一三、数据处理．．58一结果．一60．一、细胞实验．一60一二、动物实验．．61_讨论一．．．65．结论．．一66一参考文献一67一文献综述一71．发表文章及参加安评工作．78一致谢一一79—万方数据NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究摘要第一部分热应激损伤作用研究目的：通过体外、体内实验研究初步探讨热应激对细胞及组织的损伤作用。方法：1．体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用：分离C57B

2、L／6小鼠原代腹腔巨噬细胞，接种于六孔板中培养。实验分为4个大组：37℃空白对照组、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)复合38℃热应激组、LPS复合40℃热处理组和LPS复合42℃热应激组。每大组内设置三个热应激时间点(1h、2h、4h)。空白对照组细胞置于37℃细胞培养箱中正常培养lh、2h、4h：LPS复合热应激组细胞在加入LPS(100ng／m1)预处理6h后，分别置于38℃、40℃、42℃培养箱中培养1h、2h、4h。处理结束后，显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞的存活率，试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)的释

3、放水平。(2)热应激后炎症细胞因子的释放：分离、培养C57BL／6小鼠原代腹腔巨噬细胞。实验分为空白对照组、LPS组、热应激组、LPS复合热应激组。其中，LPS复合热应激组细胞经LPS预处理6h后，在38℃、40℃、42℃条件下分别孵育lh、2h、4h。ELISA法检测细胞上清白细胞介素．1D(IL．1B)、白介素一6(IL一6)和肿瘤坏死因子一cc(TNF．a)水平。2．体内研究。(1)C57BL／6小鼠分为正常对照组和LPS复合38℃、40℃和42℃热应激组，每组5只小鼠。LPS复合热应激组小鼠腹腔注射LPS(1mg／kg)，4h后给予不同温度的热刺激。测定各组小鼠初始及热应激2h

4、后(或濒死时)的肛温，存活小鼠在热应激2h后处死，取血测定血清IL．1D。(2)C57BL／6小鼠分为正常对照组和LPS组，检测LPS处理4h后小鼠血象变化。(3)C57BL／6小鼠分为正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组，每组lO只小鼠。受热后每隔15min监测四组小鼠肛温变化直至达到热射病标准42．7℃，记录生存时间绘制生存曲线。结果：1．体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用：LPS复合42℃，4h热应激处理后，细胞形态发生明显变化，细胞萎缩，体积变小，细胞间隙变大，细胞膜轮廓模糊，细胞死亡过半。LPS复合40℃，4h与LPS复合42℃，2h热应激处理后细胞少

5、量死亡。其他处理组细胞形态无明显变化。MTT测定结果显示，腹腔巨噬细胞经不同温度不同时间热应激后，LPS复合42℃，4h热应激组细胞的存活率较其他组明显降低，其余各组之间细胞存活率没有明显差异。LDH测定结果显示，37℃正常孵育1h、2h、4h，细胞上清中LDH含量均较低，细胞经LPS预处理后在38℃、40℃、42℃条件下孵育1h、2h和4h，LDH释放量随着热应激温度与时间的增加有依赖性的升高，其中，LPS复合42℃，2h热应激组和LPS复合42℃，4h热应万方数据第二军医大学硕士学位论文激组细胞LDH的释放量与空白对照组相比有显著差异。(2)热应激后炎症细胞因子的释放：与空白对照组

6、相比，LPS组、LPS复合热应激各组细胞上清中IL．1D、IL一6和n师．0【的含量均显著升高。但与LPS组相比，LPS复合热应激组细胞上清中仅IL—lD的含量明显升高，提示LPS复合热应激仅进一步促进IL．1p的分泌。2．体内研究。(1)LPS复合热应激2h(不足2h的濒死即刻测量)后，40℃热应激组小鼠和42℃热应激组小鼠肛温均高于38℃组。血清ELISA结果显示LPS复合40℃热应激小鼠的血清IL．1D水平高于38℃和42℃热应激组小鼠。(2)LPS(1mg／kg)处理4h后，小鼠血液中白细胞量(whitebloodcell，WBC)和淋巴细胞比例(％Im佃H)较空白对照组相比显

7、著降低，中性粒细胞比例(％NEUT)相比于空白对照组显著升高。(3)监测正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组小鼠体温发现，空白对照组和LPS组小鼠实验期间前后肛温无明显变化，单纯热应激组小鼠肛温平缓升高。LPS复合热应激组小鼠受热15min后肛温较单独热应激组迅速升高，且率先达到热射病标准温度42．7℃。生存分析结果显示，LPS组野生型小鼠在4h的观察期内未见死亡。单纯热应激组野生型小鼠中位生存时间为2．72h，平均生存时间