影响小G蛋白Rab40C亚细胞定位的序列分析及生物学功能研究

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1、单位代码10475申请编码10475201500599分类号R392硕士学位论文影响小G蛋白Rab40C亚细胞定位的序列分析及生物学功能研究学科、专业：免疫学研究方向：细胞生物学申请学位类别：医学硕士申请人：王卫杰指导教师：崔占军二〇一七年六月SequenceanalysisofsubcellularlocalizationofsmallGproteinRab40CandbiologicalfunctionresearchADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityi

2、nPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByWangweijieSupervisor:CuizhanjunJune.2017摘要背景：真核细胞内复杂的内膜系统是其特点之一，并且内膜系统在细胞内生命过程中发挥着极其重要的作用，不同细胞器之间的囊泡运输受多种不同的因子控制。这些小的GTP结合蛋白在膜运输系统中发挥特异性作用，并且通过作为分子开关，在囊泡出芽，运输和融合等多种细胞活动中发挥作用。小G蛋白（smallGTPases）是此过程中重要参与者之一

3、，也是近来细胞信号转导范围被关注的热点。这些小G蛋白通过发挥分子开关的功能影响几乎所有的细胞过程。接着发现许多类似的GTP结合蛋白，与Ras具有相似的结构，现在家族成员总数已超过150个，包括Ras，Rho，Ran，Rab，Rheb和ARF六个亚家族，每个亚家族扮演各自特别的角色，发挥与众不同的功能。Ras是最早被发现的成员，RAS基因编码约21kDa的蛋白质，它调节多个细胞过程包括细胞存活，生长和分化，是重要的调控枢纽。在受生长因子或其他细胞外刺激物刺激后，受体酪氨酸激酶（RTK）激活RasGEF，通过结合GTP来激活Ras，使其能够结

4、合其下游效应物发挥作用。Rab家族成员通过招募特异性效应因子到靶膜以调节细胞内的膜运输，Rab蛋白及其效应因子作用来调控细胞内重要生命过程包括蛋白质分选，囊泡运动和囊泡粘附。不同的Rab蛋白定位于不同的膜室，主要是为了膜同一性并确保膜结合的货物被运送到细胞内正确的目的地，以调节膜泡运输途径的特异性和方向性。像其他小GTP酶一样，当GTP被激活而GDP关闭时，Rab主要发挥“开”的作用，当GDP被激活而GTP关闭时，Rab蛋白主要发挥“关”的分子开关作用，GDP和GTP结合形式之间的构象差异主要涉及两个区域，称为开关I和开关II。与不同的调

5、节因子和效应因子结合，控制不同的途径。鉴于Rab在调节膜转运过程中的重要性，而膜转运对于人类健康具有十分重要的影响，研究报道有些遗传性疾病与Rab功能障碍有关，还有部分与RabGTP酶的突变相关，包括白化病，免疫缺陷和皮肤病等。研究显示Rab蛋白的功能异常与胃癌、乳腺癌等许多疾病有关。小GTP酶Rab40C是Rab家族的成员，目前对于其性质和发挥的作用尚无系统的报道。Rab40C细胞内定位及具有的生物学效应仍需探索，有利于探讨其与疾病之间相关性。本文将初步探讨Rab40C性质及其在细胞调控大网络中发挥的生物学机能。I目的：本课题首先构建R

6、ab40C的野生型表达载体，采取脂质体转染技术进行细胞内表达，通过免疫荧光技术观察其细胞内精确定位；在此基础上构建其变异型载体，观察突变体在细胞内的表达，进一步确定影响其结构和细胞内定位的氨基酸序列；免疫印迹和GST-Pulldown研究Rab40C与其有关因子的作用，为进一步探讨Rab40C的生物学功能奠定理论依据。方法：本课题采取PCR的方法，对人cDNA文库中扩增目的基因，构建GFP-Rab40C-WT/GN/QL等载体，采用免疫荧光等技术观察其亚细胞定位；应用免疫印迹等研究Rab40C与其有关因子的作用，探讨Rab40C的可能发挥

7、的作用。结果：PCR方法扩增目的片段，测序报告验证了所测片段序列正确；将构建成功的Rab40C野生型及变异型的质粒，脂质体转染细胞，实验表明Rab40C具有清楚的囊泡结构并且包围着脂滴；通过变异型载体表达结果去确定SOCS盒影响其亚细胞结构及细胞内定位；免疫荧光实验表明Rab40C与TIP47存在着部分重合现象，说明二者有一定的相关性；GST-Pulldown实验显示Rab40C与脂滴相关蛋白TIP47相互作用，推测可能与脂肪的相关代谢过程有关。结论：Rab40C是一个新发现的包裹在脂滴周围Rab，目前是继Rab18又一与脂滴有关的蛋白，

8、并且确定SOCS盒结构域决定了其结构和细胞内定位。进一步证实Rab40C和Tip47相互作用，为Rab40C深入的生物学功能研究提供参考和依据。关键词：小G蛋白Rab40C，亚细胞定位，囊泡，