油田污染土壤中石油降解菌的筛选、鉴定及其微生物多样性分析

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1、学号：12203213常州大学硕士学位论文油田污染土壤中石油降解菌的筛选、鉴定及其微生物多样性分析研究生刘雨佳赵远指导教师梁玉婷学科、专业名称环境工程研究方向土壤生物修复二〇一五年四月Investigationstoisolation,identificationandmicrobialDiversityofcrude-oil-degradingstrainsfrompetroleum-contaminatedsoilADissertationSubmittedtoChangzhouUniversityByLiuYu-jia(EnvironmentalEn

2、gineering)DissertationSupervisor:ZhaoYuanLiangYu-tingApril，2015常州大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权的说明本学位论文作者完全了解常州大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学

3、位期间论文工作的知识产权单位属常州大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在年解密后适用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日中文摘要石油在给人们带来巨大经济利益的同时，也对生态环境造成了巨大威胁。在其勘察、开采、储存及运输过程中，油田周围大面积土壤都受到严重的污染，对自然环境及动、植物均会造成

4、不同程度的危害，因此，石油污染土壤的治理具有重要意义。目前，治理石油污染土壤的方法主要有物理修复、化学修复以及生物修复，其中，生物修复（包括微生物修复和植物修复）方法因具有成本低、效果优、无二次污染、可大面积应用等优点而受到人们的广泛关注。本论文对中国江苏省淮安市金南油田（119°02′26.60″E，32°57′11.53″N）距油井不同距离的石油污染土壤进行取样，通过气相色谱法初步分析了采油区土壤中各组分的分布情况；采用平板分离技术对样本中的石油降解菌株进行分离、纯化并对纯培养进行理化性质、降解性能的测定；运用16SrRNA序列鉴别技术及克隆测序技术对

5、细菌的序列进行比对分析，并初步分析了功能基因的分布情况；利用PCR-DGGE微生物群落分析技术和克隆测序技术对污染源不同距离的石油污染土壤中的微生物多样性进行分析，考察微生物群落多样性与环境因子的关系，识别污染土壤中的优势菌群，旨在为石油污染土壤降解菌群的构建及原位生物修复提供理论依据。分别使用烘干法和气相色谱法对选定油井周边不同距离的土壤进行理化指标和石油烃类含量的测定，了解样本的初始特征及污染程度；以原油为唯一碳源，筛选出9株具有石油降解功能的菌株，分别命名为JSA01、JSA02、JSA03、JSB01、JSB02、JSB03、JSC01、JSC02

6、、JSD01。经形态观察、生理生化反应和分子技术方法鉴定，确定9株菌隶属于Pseudomonas、Raoultella、Lysinibacillus、Escherichia、Klebsiella；进一步利用通过16SrRNA基因序列同源性分析等研究方法对石油降解菌的系统发育地位进行确定。对石油降解菌的基因组DNA及质粒DNA进行提取，进一步探究alkB、LmPH、GSTs三种功能基因的分布情况；结果表明，GSTs基因广泛分布在8株菌的基因组上，同时JSA02、JSA03、JSB01的质粒上也检测到了GSTs基因；alkB分别在7株菌的基因组和2株菌的质粒中

7、检出；LmPH基因仅在JSD01的基因组上检出。利用PCR-DGGE和克隆测序技术，对石油开采区土壤微生物群落多样性进行分析发现，土壤中微生物多样性与土壤的污染程度呈负相关；最后，通过对DGGE图谱的分析，识别出石油污染土壤中的优势菌群种属指纹图谱。关键词：石油污染土壤；分子鉴定；基因分析；PCR-DGGE；微生物多样性ABSTRACTAsthepetroleumbringsaboutgreateconomicbenefits,itprovidesseriousthreattotheenvironment.Duringtheprocessofreconna

8、issance,exploitation,transportati