土壤石油降解菌的筛选与微生物生态修复研究.doc

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1、土壤石油降解菌的筛选与微生物生态修复研究第一章文献综述1土壤石油污染概述石油成分根据其在不同溶剂中的溶解难易程度可分为油质、胶质、浙青质等⑴。油质是石油中含量最高的组分，主要成分为饱和烃以及芳香轻，其溶剂范围广，可溶于大多数的中性有机溶剂，但不被桂吸附。胶质是石油中分子量较大的烃类，它只能溶解于石油醚、苯、氯仿、乙醚和四氯化碳等有机溶剂中，能被娃胶吸附，密度较小的石油胶质含量约4?5%，而较重的石油其胶质含量可达20%以上。浙青质是石油中的含硫的高分子多环有机化合物，不溶于石油醚或酒精，可溶于苯、三氯甲院及二硫化碳，同样可被娃胶吸附。2微

2、生物修复技术的研究现状微生物修复技术利用修复系统中的微生物，以环境中的污染物为底物，进行相应的代谢活动以将其分解利用，降低环境中污染物质的浓度或使其完全去除，达到环境修复的目的。与传统的物理和化学修复方法相比，微生物修复技术具有如下优点：首先，成本低：物理法需要大量且昂贵的修复仪器，而化学法需要向环境中投加大量的化学修复剂，微生物修复技术是所用方法中最廉价的；其次，无污染：物理法采用的焚烧方式会产生大量的有毒有害气体，造成污染的进一步扩散和转移，而化学试剂的大量投加使得二次污染问题越来越突出；再者，微生物修复技术不破坏待修复区域的土壤结构

3、以及地表植被，可最大限度的恢复土壤和水体的生态环境。第二章石油污染土壤的微生物生态分析1材料与方法样品来源：釆集于大庆油田地区的石油污染土壤。原油：釆自大庆油田的脱水原油，黑色粘稠液体。土壤样品采自大庆油田的表层土壤，采样地临近油井，土壤类型为常年石油污染的土壤，按与油井距离依次为5、10、15、20、30、50m处，分布A、B、C、D、E、F6个采样点，同一取样点在2in2范围内进行取样。取样时，先用取样去除1cm左右土壤表层，然后在距土层表面1~5cm深度重复釆样3次，去除样品中带有的植物残体、砂石等大颗粒杂质后，分成两份装入灭菌封口

4、塑料样品袋中并标记，一份冷冻干燥后测定土壤的含油量，以评估石油污染程度，一份置于4'C冰箱保存待提取DNA。2结果与分析石油污染导致土壤中的总有机碳含量升高，而对于土壤的其他理化性质诸如全氮、水解氮、全憐、全钾以及速效钾含量无显著影响。因此本文将土壤中的含油量作为衡量石油污染程度的指标，随着采样点与油井距离的减小，6组样品的含油量呈递增趋势，石油污染程度逐渐增高，这是符合实验预期的。本实验结合对土壤污染情况的分析，以重点分析不同污染程度下的群落特征，以及随着污染程度的变化，其微生物群落的相应更替，从中得出大庆油田石油污染程度与群落特征的变

5、化规律，探究其土著微生物群落的自身特点，为以后的生物修复工作提供生态学研究基础。T-RFLP技术通过使用具有突光标记的特殊引物，对土壤中的总微生物16SrDNA进行扩增，通过对突光信号灯检测得到扫描图谱，由于核苷酸序列就有多态性，不同的微生物种群会显示出不同的信号程度，表现在图谱上则是不同的峰，从而可以直观的显示出样品土壤的优势微生物群落的数量以及相互关系。综上所述，含油量在1104mg-kg-'(E组）以下的土壤中尚未形成已适应石油污染的微生物种群，其微生物群落尚不具备自身修复的能力，此类土壤的微生物修复更主要的是通过引进外来微生物菌群

6、进行土壤有害物质的代谢和治理。而含油量在4975mg-kg-^(B组）及以上的土壤已形成比较稳定的微生物群落，从中更有可能蹄选到高效的石油降解菌，特别的，113bp代表的优势菌群就是一个潜在石油降解菌株，同时，此类污染土壤的微生物修复工作可通过投加适当的硝酸盐和磷酸盐等外源营养物质，改善适于微生物的生长环境，以促进土著石油降解菌的对于有害污染物的降解效应。以上的研究成果将为大庆油田区石油污染土壤是生态研究、菌株蹄选与生物修复的后续工作提供科学指导和理论依据，本论文后续将选取含油量在4975mg-kg-'(B组）及以上的土壤进行高效菌株的蹄

7、选工作。第三章石油概菌的………………252结果与分析………………283本章讨论…………………32第四章萘降解苗的分………………331材料与方法…………………… 342结果与分析…………………41第五章石油降解苗群的优……………511材料和方法……………552结果勾分析……………583本章讨论…………………63第五章石油降解菌群的优化与修复效果研究1材料和方法菌株来源：已蹄选到的4株石油降解菌，分别为W-2、W-3、W-5、W-7o原油：釆自大庆油田的脱水原油，黑色粘稠液体。土壤：采自南京农业大学牌楼温室试验田。将菌群中的各菌种分别接种到液

8、体LB培养基，培养24h后各吸取25mL的菌液混合配制成100mL的菌群培养液，离心收集菌体并加入无菌水制成菌悬液。称取0.2gNH4NO3和0.02gKH2PO4溶于50mL水中配制成营养液