引起急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌MLST及耐药性研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150208411上海海洋大学硕士学位论文题目：引起急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌MLST及耐药性研究Multilocussequencetypingandantibiotic英文题目：resistanceanlysisofAHPND-causingVibrioparahaemolyticus专业：食品科学与工程研究方向：食品安全姓名：孙明玉指导教师：赵勇二O一八年五月二十七日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学

2、位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查

3、阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文引起急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌MLST及耐药性研究摘要对虾急性肝胰脏坏

4、死病（acutehepatopancreaticnecrosisdisease，AHPND）2009年首次在中国暴发，之后越南（2010），马来西亚（2011），泰国（2012）和墨西哥（2013）菲律宾（2015）等地接连发生。这是一种细菌性疾病，患病对虾死亡率极高（高达100%）。截止到2013年，AHPND给亚洲的对虾养殖产业造成了前所未有的危害，致使每年经济损失超过10亿美元，并且仍有进一步扩大的趋势。2013年Lightner等研究发现引起AHPND的元凶是一种被噬菌体病毒感染后发生了

5、变异的副溶血性弧菌。2015年台湾的研究小组选择自然缺失与实验删除pirA和pirB毒力基因的突变株进行试验，发现两类突变株致病能力均消除，为此进一步证实PirA和PirB毒素是引起急性肝胰腺坏死病的最终病因。在现有的研究基础上，发展面向凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的高效诊断及防控技术研究，是减少AHPND疫情的风险，使虾农受益的关键。本课题从AHPND的诊断入手，建立荧光原位杂交检测方法，可视化的监测环境及对虾组织中的致病菌，进一步证实本实验室保存的AHPND菌株具有致病性。其次是以该致病株为实

6、验材料，并下载国际上其他地区AHPND致病株的管家基因信息，分析全球范围内AHPND致病菌的流行性和遗传学关系。最后我们从基因型和表型两方面研究AHPND致病菌的耐药性，为促进对虾养殖业的健康可持续发展提供理论依据，这对我国的水产生态安全和经济发展具有重要的现实意义。1.VPAHPND荧光原位杂交检测方法的建立本研究基于pirA基因设计荧光原位杂交探针，检测引起对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血性弧菌。通过序列比对软件ClustalX发现现有的pirA基因保守无突变，采用PrimerPremier5软

7、件设计探针。探针核酸序列通过NCBI数据库BLAST选项初步检验不匹配他种属非AHPND菌株。为进一步验证其特异性，选取21株非AHPND致病菌和12株AHPND致病菌进行验证，FISH检测可以鉴别出12个AHPND阳性样本，与PCR检测方法结果一致。本研究设计的pirA探针与AHPND致病性的副溶血性弧菌杂交时，荧光信号清晰，菌体形状明显。同时用pirA探针检测患病对虾肝胰腺切片时看到有明显的致病菌存在。FISH可以用来检测环境和虾组织中的AHPND致病性的副溶血性弧菌。本研究将为更好地了解这

8、些环境微生物对水产品的危害提供更多的工具。I上海海洋大学硕士学位论文2.引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型本研究针对不用地区急性肝胰腺坏死病致病性副溶血弧菌，运用多位点测序技术，分析了致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA，对AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。同时收集不同地区AHPND致病性副溶血弧菌的MLST数据，采用eBURSTV