尼罗罗非鱼RLR与NLR家族6个基因的克隆、功能分析及IPS-1基因、NOD1基因SNPs与抗病性状的相关性分析

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1、上海海洋大学博士学位论文学校代码：10264研究生学号：D130101002上海海洋大学博士学位论文尼罗罗非鱼RLR与NLR家族6个基因的克题目：隆、功能分析及IPS-1基因、NOD1基因SNPs与抗病性状的相关性分析Molecularcharacterization,functionalanalysisofsixgenesofRLRsandNLRsandthe英文题目：associationofIPS-1andNOD1geneSNPswiththediseaseresistancetraitsinNiletilapia(Oreochromisniloticus)专业：水产养殖研

2、究方向：水产动物免疫学与病害防控姓名：高风英指导教师杨先乐二O一八年三月二十九日上海海洋大学博士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论

3、文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学博士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注上海海洋大学博士学位论文尼罗罗非鱼RLR与NLR家族6个基因的分离、表达特征及IPS-1基因、NOD1基因SNPs与抗病性状的相关性分析摘要罗非鱼是我国重要的淡水养殖对象，但近年来由于罗非鱼链球菌病的暴发，严重威胁到罗非鱼产业的健康可持续发

4、展。目前尚未研制出有效的防治措施。开展罗非鱼免疫相关基因的功能分析工作，阐明罗非鱼的免疫调控机制，为进行抗病相关标记的筛选，辅助抗病罗非鱼品种的选育提供基础数据，对于罗非鱼链球菌病的防治工作具有潜在的应用价值。先天免疫在鱼类免疫反应中起重要作用。模式识别受体是先天免疫受体的重要成员。模式识别受体与病原相关分子模式的相互作用，是先天免疫反应的第一步。目前发现模式识别受体有三家家族：Toll样受体(Toll-likereceptor，TLR)，NOD样受体(NOD-likereceptor，NLR)，RIG样受体(RIG-likereceptor，RLR)。Toll样受体是了解的最清

5、楚的，其在多种传染病中的功能都得到了很好的解释。NLR和RLR家族基因了解的还比较少，尤其是在低等脊椎动物。本论文从NLR和RLR受体基因入手，克隆得到尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)NLRs(NOD1，NOD2和NLRC3)和RLR(MDA5,LGP2和IPS-1)基因的全长cDNA及基因组序列，实时定量PCR检测其在各组织和器官及胚胎发育过程中的表达量以及感染无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)后表达的变化；构建各基因真核表达载体，并研究哺乳动物细胞中过表达上述基因后，对NF-κB活性的影响；用克隆测序的方法分析IPS-1和NOD

6、1基因多态性以及该基因多态性与罗非鱼无乳链球菌病抗性的关系，为罗非鱼抗病品系选育提供理论基础。主要结果和结论如下：1.尼罗罗非鱼NLRs基因的克隆、表达特征及其功能分析采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术得到RLRs的cDNA序列，并用特异引物直接扩增法获得其基因组序列。尼罗罗非鱼NOD1(OnNOD1)，I上海海洋大学博士学位论文NOD2(OnNOD2),NLRC3(OnNLRC3)cDNA序列全长分别为3924bp，3886bp，4574bp。分别编码941,986,1130个氨基酸。NOD1基因组序列14138bp(GenBank登录号：MF479261)，包含12个外显

7、子；NOD2基因组序列5851bp(GenBank登录号：MG680275)，包含11个外显子；NLRC3基因组序列17335bp(GenBank登录号：MG680276)，包含19个外显子。3个NOD样受体均具有NACHTdomain和C-末端富亮氨酸重复区域。另外，NOD1和NOD2还具有N-末端CARDdomain。系统进化树分析显示：3个RLR基因高度保守。组织表达分析显示：3个受体均在脾脏中高表达。3个受体在受精后不同发育时期的表达情况显示：NOD2和NLRC3从受精后