毛竹抗病phewrky1基因的克隆与功能分析

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1、学位论文毛竹抗病PheWRKY1基因的克隆与功能分析学位论文作者崔晓伟指导教师姓名高健研究员申请学位级别硕士专业名称林木遗传育种研究方向植物抗逆分子生物学论文答辩日期2011年6月中国·北京万方数据DissertationfortheDegreeIsolationandFunctionalCharacterizationofPheWRKY1GeneRelatedtoDiseaseResistanceinMosoBambooCandidate:CuiXiaoweiSupervisor:Prof.GaoJ

2、ianAcademicDegreeAppliedfor:MasterDegreeForestTreeGeneticsandSpeciality:BreedingDateofDefence:June,2011Degree-Conferring-Institution:ChineseAcademyofForestry万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包

3、含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位

4、论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：年月日年月日学位论文作者毕业联系方式工作单位：联系电话：电子邮件：通讯地址、邮编：万方数据摘要植物在长期进化过程中形成了一个复杂的调控体系来抵御病害胁迫的影响，包括本身保护性生理屏障以及一系列抗病相关基因的诱导表达。仅存在于植物中的WRKY转录因子基因，构成转录因子超家族，广泛参与植物抗逆反应以及多种生理代谢过程。为了探讨WRKY转录因子基因在毛竹中的作用，本研究从毛竹(Phyllostachysedulis)中克隆了一个PheWRKY1基因，对其

5、编码蛋白的氨基酸序列及其表达特性进行了分析，并将其在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中增强表达，对所获得的转基因株系的抗病性进行了初步研究。通过RT-PCR技术，克隆得到PheWRKY1基因。序列分析表明，该基因全长1080bp，包括一个579bp开放阅读框，编码一个由193个氨基酸组成的蛋白质，相对分子量为20.8KDa，等电点为5.99，基因注册号为GU944762。序列分析表明，PheWRKY1基因的氨基酸序列含一个WRKY结构域和一个锌指结构C2H2，属于WRKYⅡ亚组。Phe

6、WRKY1基因编码蛋白的保守元件与禾本科植物甘蔗、水稻、小麦、黑麦草等有很高的一致性，在86%以上，与拟南芥中AtWRKY51同源性达47%。经生物信息学软件预测得知，PheWRKY1蛋白定位于细胞核内，蛋白的三级结构与禾本科植物黑麦草类似，并且该蛋白具有转录调控和信号转导等功能。对毛竹实生苗进行多种胁迫和诱导处理，提取叶片总RNA，用实时定量PCR方法分析目的基因表达模式。结果表明，外施抗病信号分子水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）均可以诱导PheWRKY1增强表达，但前者增强幅度更大，保持时间更长；紫

7、外线B辐射也能诱导基因增强表达；外施脱落酸（ABA）和干旱胁迫，PheWRKY1表达无明显变化。野外毛竹林中感染毛竹丛枝病与枯稍病样本中PheWRKY1基因表达也有所增强。提示PheWRKY1可能通过水杨酸和茉莉酸转导途径参与病原菌诱导的信号传递，而不参与对渗透胁迫的反应。为研究PheWRKY1基因能否与顺式作用元件的W盒结合，构建了PheWRKY1基因的原核表达载体，将其转入pET-28a，并使重组质粒pET-WRKY在大肠杆菌中经IPTG诱导得到了有效的异源表达。I万方数据对PheWRKY1基因构

8、建植物过表达载体并转化模式植物拟南芥，目前已经得T2代转基因株系。转基因植株表现出不同的形态学特征，根系发达、叶片肥大、茎粗壮，提前开花且结种不良，推测PheWRKY1基因的过表达影响了转基因株系的生长发育。为进一步分析PheWRKY1基因是否调控植物抗病反应，本实验用丁香假单胞菌PseudomonassyringaePVTomatoDC3000(简称DC3000)侵染拟南芥，各实验材料在1d会出现小的病斑，然后病斑会向四周扩散。但随后转基因株系的病斑被