gdp-甘露糖焦磷酸化酶（gmpp）原核表达和性质表征

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1、山东大学硕士学位论文GDP．ManPCRManMan．1．PMan．．6．．PGlc-6．PF刚．6．PbpAmpEBGDP．FucEDTAghIPTGKbkDaMCSMminmoIODPAGEPBSSr，min缩略词表GDP-mannoseGDP．甘露糖PolymeraseChainReaction聚合酶链式反应Mannose甘露糖Mannose-1-P甘露糖．1．磷酸Mannose．1．P甘露糖．6．磷酸Glucose-6-P葡萄糖-6-磷酸Fructose-6-P果糖．6．磷酸basepair碱基

2、对Ampicillin氨苄青霉素Ethidiumbromide溴化乙锭GDP-fucoseGDP一岩藻糖Ethylendiaminetetraacetate7,--胺四乙酸gram克hour小时Isopropyl13-D-thiogalactopyranoside异丙基⋯13D硫代半乳糖苷Kilobases千碱基对KiloDalton千道尔顿Multiplecloningsite多克隆位点mol／L摩尔，升Minute分钟6．02X1023摩尔Opticaldensity光学密度Polyacrylami

3、degelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳Phosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液Second秒Roundperminute转／每分钟5山东大学硕士学位论文TempUVUgULSDSGMPPCEPPiPiTemperatureUItravioletMicrogramMicroliterSodiumdodecyIsulfate温度紫外微克微升十二烷基硫酸钠GDP—mannosepyrophosphorylaseGDP-甘露糖焦磷酸化酶CapillaryElectroph

4、oresis毛细管电泳焦磷酸(盐)磷酸(盐)6原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：塑：!三翌日期：型：!!夕9关于学位论文使用授权的声明本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或

5、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：伍)翘导师签名：之衄量日期：兰!：竺：乡．矽山东大学硕士学位论文摘要GDP．甘露糖是一种广泛存在于各种生物体内的糖基供体和代谢中间物，其在原核生物中主要参与O．抗原等寡糖的生物合成【1】；在真核生物中主要作为蛋白质糖基化的重要糖基供体和其他糖核苷酸生物合成的前体【21；在某些植物中参与维生素C生物合成【3】。可见大量得到GDP一甘露糖的纯品可以为糖蛋白的生产、实验室研究

6、提供必要的物质基础。然而在生物体内，GDP．甘露糖的含量普遍很低，通过对野生型生物材料分离纯化而得到GDP．甘露糖几乎不可能。如果能够高效表达GDP一甘露糖生物合成所需的酶系，并且对此酶系中各个酶的性质都有比较透彻的了解的话，我们则可以体外合成GDP一甘露糖。在大多数生物体中，GDP．甘露糖的生物合成途径如下【41：由甘露糖起始，经己糖激酶催化生成甘露糖一6一磷酸，甘露糖．6一磷酸在磷酸己糖异构酶的催化下生成甘露糖一1一磷酸，以甘露糖一1一磷酸和GDP(GTP)为底物在GDP．甘露糖焦磷酸化酶作用下最终

7、合成GDP．甘露糖。其中，对己糖激酶和磷酸己糖异构酶的性质已经研究的相对比较透彻，并且有晶体结构的报道【5】，而对GDP．甘露糖焦磷酸化酶的研究相对较少，所以本实验原核表达了大肠杆菌来源的GDP．甘露糖焦磷酸化酶并做了比较详尽的酶动力学研究。按底物种类，我们能找到两种类型的GDP．甘露糖焦磷酸化酶：类型l(EC2．7．7．13)利用GTP和甘露糖-1一磷酸为底物，类型¨(EC2．7．7．22)则利用GDP和甘露糖一1一磷酸为底物。参照以往的报道【6，7】，E．coliKl2来源的GDP一甘露糖焦磷酸化酶

8、属于类型¨，我们通过PCR技术扩增得到了来源于EcoliK12的GDP一甘露糖焦磷酸化酶基因印sB，并定向克隆到原核表达载体pET-22b上，转化EcoilBL21(DE3)，发酵重组菌株至指数期，加入诱导物IPTG，使GDP．甘露糖焦磷酸化酶基因得到高水平表达，超声破碎细胞，上清经Ni．NTAHis·Bind@Resins亲和层析纯化，最后SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的表达水平和纯度。带有His．tag的重组CpsB大小为52kDa