原核表达步骤总结

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1、原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一）制样1.挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ulLB培养基，加入0.7ulAmp（100mg/mL），37oC200r/min摇床培养，过夜活化。2.以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mLLB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37oC200r/

2、min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3.从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ulIPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37oC摇床培养3h。4.以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物

3、。5.加入1mldH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。6.重复步骤5。将离心管中的水倒干净。（二）菌落SDS-PAGE1.在收集的菌体中加入200ul1×SDSPAGEloadingbuffer(可根据沉淀的量增加或减少loadingbuffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。2.将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker20ul

4、。（三）SDS-PAGE分析1.根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶蛋白分子量(kDa)凝胶浓度(%)4-402012-451510-701215-1001025-2008分离胶（两块）配方15%12%8%ddH2O3.4ml4.9ml6.9ml30%Acr-Bis(29:1)7.5ml6.0ml4.0ml1.5MTris-HCl（pH8.8）3.8ml3.8ml3.8ml10%SDS150ul150ul150ul10%过硫酸铵150ul150ul150ulTEMED20ul20ul20ul总体积15ml15ml15ml按表中所列顺序从上到下

5、加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后，用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温（37℃）凝结30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。2.制作浓缩胶浓缩胶（两块）配方5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis(29:1)0.85mL1MTris-HCl（pH6.8）0.63mL10%SDS50uL10%过硫酸铵50uLTEMED20uL总体积5ml胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温(37℃)凝胶30min。3.胶凝好后，拔梳子

6、，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液没过点样孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极4.Marker点5uL，用10uL小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压打到70V，保证电流在20mA-30mA之间，当样品跑入浓缩胶时可适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。5.当溴酚蓝电泳至胶槽底部时,一般需要2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。6.用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透

7、明，期间可每2h更换一次脱色夜。根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。一．鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白1.从冻存的菌液中取10ul，接种于5ml的LB培养基中，加入5ulAmp(100mg/ml),过夜活化菌株。2.按照1：50的比例，从活化的菌株中，取1ml菌液接种于50mlLB培养基中，加入50ulAmp(100mg/ml)，扩大培养3h。1.扩大培养后的菌液,取出10ml，不加IPTG，作为空白对照。剩余的40ml菌液中加入40ulIPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37℃，200rpm的条

8、件下培养3h。2.用50ml离心管收集菌体，8000rpm，离心3min。注意配平。3.倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌体一遍，