原核表达的详细步骤.doc

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1、.原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1.得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①  利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。②  实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。③  利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。2.注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分

2、为completeCDS和partialCDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，completeCDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partialCDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。二、抗原决定簇的预测1、        原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在部的抗原决定簇也

3、会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。2、        选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N端及C端是很好的抗原决定簇区域。3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线预测（-b

4、imas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/index.shtmland  .imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html  ）（2）选定：接近N、C端；选取在此区间，（AntigenicIndex）Jameson-wolf抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicityplot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域（3）NCBI（BlastP）比对

5、：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！！！（4）抗原合成：①原核表达：..②化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好，一般>80%就完全可以了。合成5-10mg就可以了。PartⅡ选择表达系统一、选择表达载体1、选择表达载体的原则（1）蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达，是否加标签或以融合蛋白的形式表达。（2）蛋白需求量：根据实验方案确定蛋白需求量，选择合适的载体。（3）蛋白质是

6、否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达（胞质蛋白），无活性的不溶的蛋白（包涵体蛋白）2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列：用于筛选重组子，有抗生素抗性基因、报告基因（GFP等）（2）可控转录的启动子：启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序

7、列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow盒，又名TATA盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35bp处，有一段由10bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。原核表达系统常使用的可

8、调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac