壳聚糖-硬脂酸嫁接物蛋白质dna三元复合物基因给药系统研究

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1、浙江大学硕士学位论文壳聚糖--硬脂酸嫁接物/蛋白质/DNA三元复合物基因给药系统研究姓名：严晶晶申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：胡富强2013-03-02浙江大学硕士学位论文中文摘要壳聚糖-硬脂酸嫁接物／蛋白质眦三元复合物基因给药系统研究浙江大学药学院药剂学2010级硕士研究生严晶晶导师胡富强教授中文摘要壳聚糖．硬脂酸嫁接物胶束具有较强的肿瘤细胞摄取能力和细胞核转运功能，其阳离子特性可有效密接质粒DNA，实现有效的基因转染和体内外抗肿瘤疗效。前期研究结果表明：壳聚糖．硬脂酸嫁接物胶束负载基因药物进入靶细胞后，基因药物的有

2、效释放是制约其基因转染效率的主要因素。本研究为实现基因药物在靶细胞内的有效释放，构建壳聚糖．硬脂酸嫁接物／蛋白质／质粒DNA三元基因给药系统，考察蛋白质的等电点对其基因转染效率的影响。采用酶解法制备低分子量的壳聚糖(c地osan，CS)，以碳二亚胺(EDc)为交联耦合剂，合成壳聚糖一硬脂酸嫁接物(Stearicacidgrmedc址osaIl，CS．sA)。核磁共振氢谱确证嫁接物的化学结构；三硝基苯磺酸法测定氨基取代度；芘荧光法测定临界胶柬浓度；动态光散射法测定嫁接物胶束的粒径；透射电镜观察胶束的形态学特征。采用乙酰氯催化法酯化

3、牛血清白蛋白(BsA)合成不同等电点的BSA，融a电位法测定等电点。分别制备Cs．S～DNA二元复合物和含有不同等电点蛋白质的cS．sA／BsA，DNA三元复合物。测定二元、三元复合物的粒径并观察复合物的形态；凝胶电泳分析嫁接物胶束与DNA的密接程度。以pEGFP．Cl作为报告基因，HEK293细胞为模型细胞，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪测定转染效率，比较二元复合物及三元复合物的转染差异；激光共聚焦比较二元、三元复合物的细胞摄取及胞内释放行为，流式细胞仪定量摄取效果；MTT法考察给药系统的细胞毒性。本研究进一步

4、以S1】rvivin为靶点，设计并合成恻A重组质粒(pshSuR)。建立实时荧光定量PcR方法，筛选最佳干扰质粒；采用最佳转染处方制备干扰RNA给药系统CS．SA／BS～pshSUR，并以1TT浙江大学硕士学位论文中文摘要人乳腺癌药物敏感细胞(McF．7)和耐药细胞(McF．7／Adr)为模型细胞，考察基因治疗联合化疗药物紫杉醇给药后，逆转耐药细胞McF．7／A出耐药行为。研究结果表明，通过碳二亚胺介导得到了两亲性的壳聚糖．硬脂酸嫁接物(cs．SA)。核磁共振氢谱确证了cs．sA的化学组成；所合成的cs—sA的氨基取代度为7．4

5、％；临界胶束浓度为81．0pg／L；浓度为1mg／Ⅱ儿的嫁接物胶束数均粒径为36．4±O．9IlIIl，电位为32．7±1．2mV；透射电子显微镜结果显示胶柬呈球形，粒径较小，分布均一。嫁接物胶束具有较强的密接DNA能力，所形成的CS．SA／DNA二元复合物，粒径较小且分布均一。通过乙酰氯催化法合成了等电点分别为4．7、6．0、9．3的BsA，采用共孵育法制备Cs．S加SA／DNA三元复合物。结果表明：当WBsA用cs_SA比由0．1增至0．5时，嫁接物仍可有效密接DNA。当BSA含量较低时，三元复合物与二元复合物相比较粒径差异

6、不是很明显均小于200IlIn，且不影响细胞摄取；体外基因转染结果显示：BsA的等电点显著影响嫁接物介导的基因转染效率。与二元复合物相比，Cs．sA／BsA(6．o)仍NA三元复合物的基因转染效率略有增加；cS．s们sA(4．7)ElNA转染效果进一步增加，且接近阳性Lipofect锄i11e1M2000对照；而cs．sA／BSA(9．3)／DINA对转染效率起抑制作用。采用等电点为4．7的BsA促进基因转染的效率，在于其负电荷性质促进基因药物的释放。本研究建立了准确可靠的实时荧光定量PcR(RT．PcR)方法学，并采用RT．P

7、cR技术筛选出最佳干扰质粒。以三元复合给药系统基因治疗结合紫杉醇的化疗研究结果表明，经基因治疗后可有效增加耐药细胞McF．7／Adr对紫杉醇的敏感性，其逆转耐药倍数为9倍，而对敏感细胞McF-7无明显作用。关键词：壳聚糖；硬脂酸；牛血清白蛋白；等电点；基因释放；RNA干扰；surVivin；逆转耐药浙江大学硕士学位论文英文摘要studiesongenede脚e碍systemmematedbystearicac试graRedchitosan／pmtein咖NAtemarycomplensDepartmentofPh锄aceutic

8、sCollegeofPha砌aceuticalSciences，ZhejiangUIlivers畸GraduateStudent：Mentor：AbstractJill西iIlgYaIlFu—QiangHuProfessorStearicacid-gr啦edc1