混合补料诱导高拷贝重组毕赤酵母高效表达x_hbsag

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1、中国生物制品学杂志2010年5月第23卷第5期ChinJBiologicalsMay2010，Vol.23No.5·521·中国图书分类号R373.2+1Q786文献标识码A文章编号1004-5503（2010）05-0521-05【实验技术】混合补料诱导高拷贝重组毕赤酵母高效表达X-HBsAg王龙刚王宇凯何成楼觉人杨忠东【摘要】目的对高拷贝重组毕赤酵母表达X-HBsAg的诱导策略进行优化。方法在摇瓶中分别诱导1、4、8拷贝数的重组毕赤酵母，ELISA检测X-HBsAg的表达量；在15L发酵罐中对

2、8拷贝的重组毕赤酵母进行诱导表达，分别考察甘油浓度对菌体比生长速率的影响、过渡阶段混合补料对菌体生长及细胞相对活性的影响、诱导阶段比生长速率对目的蛋白表达的影响以及诱导阶段混合补料对目的蛋白表达的影响。结果8拷贝的重组毕赤酵母在摇瓶中诱导表达的X-HBsAg量明显高于1和4拷贝重组子。优化的发酵诱导策略为：初始补加甘油阶段控制甘油浓度在15g／L；过渡阶段采用甲醇与甘油混合补料，控制甘油浓度在限制性浓度以下；诱导阶段采用甲醇与甘油混合诱导X-HBsAg表达，诱导初始阶段控制比生长速率在0.015／

3、h以上，中后期在0.002／h左右；发酵92h，X-HBsAg的表达量比单纯甲醇诱导提高约67%。结论混合补料诱导较单纯甲醇诱导策略更有利于高拷贝重组毕赤酵母表达X-HBsAg。【关键词】混合补料；X-HBsAg;高拷贝基因；毕赤酵母；发酵InductionofHighExpressionofMulti-copyRecombinantX-HBsAgGeneinPichiapastorisbyMixedFeedingWANGLong-gang,WANGYu-kai,HECheng,etal（Shan

4、ghaiInstituteofBiologicalProducts,Shanghai200052,China）【Abstract】ObjectiveTooptimizethestrategyforinductionofhighexpressionofmulti-copyrecombinantX-HBsAggeneinPichiapastoris.MethodsTherecombinantP.pastoriswithone-,four-andeight-copyX-HBsAggeneinshake-

5、flaskculturewerein－duced,andtheexpressionlevelsofX-HBsAgweredeterminedbyELISA.TherecombinantP.pastoriswitheight-copyX-HBsAggenewasinducedin15Lfermentor,andtheeffectsofglycerolconcentrationonspecificgrowthrateofyeast,mixedfeedingattransitionphaseongrow

6、thandrelativeviabilityofyeastcellsaswellasspecificgrowthrateofyeastcellsandmixedfeedingatinductionphaseonexpressionoftargetprotein,wereevaluated.ResultsTheexpressionlevelofeight-copyrecombinantX-HBsAggeneinP.pastorisinshake-flaskculturewassignificantl

7、yhigherthanthoseofone-andfour-copyones.Thestrategyforinductionbyfermentationwasoptimizedasfollows:theglycerolconcentrationatglycerolfeedphasewascontrolledat15g／L;themixedfeedingwithmethanolandglycerolwasadoptedattransitionphase,whiletheglycerolconcent

8、rationwascontrolledbelowtherestrictiveconcentration;themixedinductionwithmethanolandglycerolwasadoptedatinductionphase,inwhichthespecificgrowthrateofyeastcellswascontrolledatmorethan0.015／hatearlystageandabout0.002／hatintermediateandlatestages