毕赤酵母高拷贝筛选、鉴定SOP

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1、毕赤酵母重组子高拷贝筛选.鉴定SOP一、仪器、培养基、耗材1•仪器恒温培养箱PCR仪电泳仪2•培养基YPD固体/液体培养基MD培养基MM培养基3•耗材96孔板灭菌才签二、实验操作1.高拷贝转化子筛选需要三组各两块96孔细胞培养板（共6块）來筛选。通过持续接种，得到相同浓度的克隆子，以确保zR平板上细胞数相等。记住要有菌株背景对照及单拷贝基因对照。一般每180个克隆，可选出1~5个髙拷贝克隆。1.1无菌条件下，将每个96孔细胞培养板上加入200plYPD：1.2用灭菌牙签在第一组平板中每孔接种单个zR垂组子以及空白毕赤酵母X・33（GS115）、GS115/Albumin和GS11

2、5/pPICZ/lac乙轻轻搅动以悬浮细胞，盖住微量测定板30度孵育2天（不需摇动）；1.3天后，取新的96孔细胞培养板，加入190glYPD,用多道移液器吸取10

3、11培养液于第二组测定板中，30度孵育过夜（不需摇动）；1.4第二天，取新的96孔细胞培养板，加入190MYPD,用多道移液器吸取10

4、il培养液于第三组测定板中，30度孵育过夜（不需摇动）；注意：如此，持续生长及传代可使克降达到相同细胞浓度1.5孵育后，取第三组板，用100卩1多道移液器上下吹打重新悬浮细胞;1.6取1・2小每孔中液体点在含zeocin浓度为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml的Y

5、PD平板上；in用多道移液器或在平板底下划线，确保以规则方式排列。1.7待液体吸收，将板放于30度，2〜5天后检测，分析结杲。也可选择直接表达來看是否有克隆及人量表达口的蛋白。先检测所有zR克降的Mu(+表型，ZR的ME表型重组子明显大量表达蛋白，用southernblot分析拷贝数，确定拷贝数冃(确保划线纯化单克隆，并加入甘油冰冻保存zR抗性克隆,每次从冻存样本中挑菌开始表达研究而不是从老的平板上挑菌)。2.Mut十表型菌株的筛选把筛选出的高拷贝重组子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的重纽子为MuF;相反，在MD±生长快，MM±生长很慢的重组子为Muts

6、,同时点酵母GS115/Albumin或KM71或KM71H(Muts)和X-33或GS115/pPICZ/lacZ(Mut+)菌落作对照，以便筛选时判断高拷贝重组子的Mut+或Mutso3.毕赤酵母重组子的PCR及测序鉴定3.1摇菌挑取高拷贝转化子单菌落于5mlYPD液体培养基屮，30°C250r/min振荡培养过夜。3.2毕赤酵母基因组DNA提取煮•冻•煮法提毕赤酵母基因组DNA：取2.5.1培养的菌液1ml于1.5ml灭菌的EP管屮，2500Xg离心5min,弃上清，沉淀屮加入500卩1的PBS溶液悬浮沉淀，2500Xg离心3min；弃上清，沉淀溶于100（11TE,沸水浴

7、lOmin,・70°C冷冻30min,再次沸水浴lOmin,1500Xg离心5min,取上清为模板做PCR。注：实践及文献证明煮•冻•煮法提取酵母基因组效率较低，容易造成假阴性！天根公司酵母基因组提収试剂盒效果较好。3.3PCR扩增鉴定①反应体系:lOxBuffer5(1110mMdNTP3(il模板DNA2plPll

8、ilP2lplTaq酶IplMgCl24

9、ilddH2033.0pl总体积50.0pl②PCR反应程序:95°C预变性5min；94°C50s,55°C50s,72°C2min,扩增30个循环；72°C延仲lOmin；4°C,oo。3.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳取

10、PCR产物5

11、11,1%琼脂糖凝胶电泳，120V,30-50min,电泳结束，凝胶成像系统拍照分析。3.5PCR产物测序（可选做）电泳结果显示DNA片段人小和目的基因分子量人小相一致的PCR产物,送上海生工测序及分析鉴定。