isecp1介导志贺菌耐药的分子基础研究

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1、AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofdoctorStudyontheMolecularBasisofISEcplInvolvedinDrugResistanceinShigel／aByYingfangWangSupervisor：Prof．GuangcaiDuanMedicineCollegeofPublicHealthDec2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其

2、他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：立—较弓日期：扣131年l≯月哆日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论

3、文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：王凝弓日期：枷I>年I工月f弓日摘要ISEcpl介导志贺菌耐药的分子基础研究博士研究生王颖芳导师段广才教授郑州大学公共卫生学院郑州450001志贺菌属细菌又称痢疾杆菌，是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体。菌痢是全球都存在的一个公共卫生问题，尤其对发展中国家造成重大危害。志贺菌属根据O抗原分为4个群：分别为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌。随着人们对各种抗生素持续广泛的应用，甚至滥用，使志贺菌耐药现象愈发严重，不但影响临床疗效，而且严重增加治

4、疗成本和新药研发成本，并使新药应用于临床的周期缩短。因此，研究志贺菌耐药机制，进而为志贺菌耐药的防治提供科学依据和有效手段，已成为目前的研究热点。插入序列(IS)是可以独立存在的遗传单元，是染色体的特殊组成部分，可以从染色体上的一个位置转移到另一个位置，或在不同染色体问跳跃。最近有学者报道，ISEcpl可能与细菌D．内酰胺类抗生素耐药有关。目的本课题通过药物诱导、基因测序等手段，比较志贺菌敏感株诱导前后ISEcpl与blacTx．M的位置关系及blacvx．M的表达的变化，以阐明ISEcpl诱导转座影响细菌耐药的分子机制。并进一步收集志贺菌株进行ISE

5、cpl、blacrx．M的分布、头孢菌素耐药情况及二者对应关系的分析，从而对所阐明的机制提供现场佐证。方法1．志贺菌的收集、鉴定：从河南、江西收集志贺菌233株，并进行血清、生化鉴定；2．药敏试验：用纸片扩散法测定菌株对所研究抗生素药敏纸片的抑菌环，用琼脂稀释法测定菌株的最低抑菌浓度；3．头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验：采用改良K．B法筛选临床分离、鉴定的志贺摘要菌敏感株，用琼脂稀释法测定志贺菌敏感株对头孢噻吩的最低抑菌浓度，采用头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验构建志贺菌诱导耐药株；4．全基因组测序分析比较志贺菌敏感株诱导前后差异：Solcxa全基因组测序，并利

6、用Clustal等生物学软件进行比较、分析；5．ISEcpl转座及对blacrx．M表达的影响：通过PCR、克隆和测序分析比较诱导前后ISEcpl与blacTX-M的位置关系；并将克隆构建质粒转化入感受态细胞DH5a，K-B琼脂法对不同转化子进行药敏试验及超广谱B．内酰胺酶表型确证试验，同时做RT．PCR，阐明ISEcpl诱导转座后对blacrx．M的表达的影响；6．ISEcpl与blacTx．M的分布及菌株耐药情况：PCR检测所收集志贺菌的ISEcpl与blacTX-M，K．B实验进行头孢菌素耐药性检测，将耐药情况与所检测目的基因进行对应分析。估电；

7、日木1．对志贺菌敏感株mel．sfl998023／zz进行头孢噻吩次抑菌浓度诱导，最终得到诱导后头孢噻吩MIC为512mg／L，是诱导前出发菌株的32倍。2．头孢噻吩诱导志贺菌敏感株mel．sfl998023／zz的前后，不但对头孢噻吩的耐药性发生了改变，同时测得诱导后菌株对头孢唑啉、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟均由敏感转变为耐药。3．头孢噻吩诱导志贺菌敏感株使其耐药后，基因组序列发生了改变，不但有SNV，还造成了新的插入和缺失，且诱导前后菌株插入序列的拷贝数发生了变化。4．通过比较志贺菌出发敏感株与诱导耐药株的KEGG代谢通路发现诱导耐药

8、株比出发敏感株多一个代谢通路k000930：Caprolactamdegradation，即己