姜黄素对塞来昔布影响胎鼠神经发生的干预作用及其机制研究.pdf

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1、分类号：R68密级：公开学校代码：11065学号：2015010037学术博士学位论文姜黄素对塞来昔布影响胎鼠神经发生的干预作用及其机制研究作者姓名王荣指导教师孙康教授学科外科学（骨外）培养单位医学部答辩日期2018年5月18日姜黄素对塞来昔布影响胎鼠神经发生的干预作用及其机制研究摘要目的：本实验旨在研究孕鼠中晚期应用塞来昔布是否会抑制胎鼠前额叶皮质中新生神经元的生成，以及是否会对神经干细胞的增殖产生影响，并探究其作用机制，并进一步探究姜黄素能否对抗塞来昔布对胎鼠神经发育造成的影响及其作用机制。以期望通过我们的研究结果对日后临床指导用药具有一定的帮助。方法：第一部分：1、动物实验：对C57BL

2、/6J小鼠进行人工合笼配对，筛选合适的孕鼠在胎龄为16.5天时随机分为：对照组、塞来昔布组，对照组在胎龄16.5天和17.5天时分别给予生理盐水10ml/kg灌胃，共计2次，塞来昔布组在相同时间给予含有30mg/kg塞来昔布的生理盐水10ml/kg灌胃，将孕鼠脱颈处死，取胎鼠前额叶皮质，冰冻切片后进行免疫荧光染色，观察两组胎鼠前额叶皮质中新生神经元的数量、神经干细胞的增殖情况。2、细胞实验：对C57BL/6J小鼠进行人工合笼配对并筛选合适的孕鼠，在胎龄16.5天时脱颈处死，取胎鼠前额叶皮质，分离培养神经元和神经干细胞，并将其分别随机分为对照组和塞来昔布组，对照组将细胞置于DMSO溶液中48小时

3、，塞来昔布组的DMSO溶液中加入塞来昔布使其浓度为50μM，对两组分别进行免疫荧光染色，观察神经元轴突形态、神经干细胞增殖情况。第二部分：1、动物实验：将胎龄16.5天的C57BL/6J小鼠随机分为：对照组和塞来昔布组，对照组在胎龄16.5天和17.5天时分别给予生理盐水10ml/kg灌胃，共计2次，塞来昔布组在相同时间给予含有30mg/kg塞来昔布的生理盐水10ml/kg灌胃，将孕鼠脱颈处死，取胎鼠前额叶皮质进行Westernblot、免疫荧光染色等观察神经干细胞的增殖情况、细胞周期蛋白CyclinD1的表达情况以及Wnt/β-Catenin信号通路中GSK-3β、β-Catenin等相关蛋

4、白的表达。2、细胞实验：将胎龄16.5天的C57BL/6J小鼠脱颈处死，取胎鼠前额叶皮质，分离培养神经元和神经干细胞，然后分别分为对照组和塞来昔布组，对照组将细胞置于DMSO溶液中48小时，塞来昔布组的DMSO溶液中含有浓度为50μM塞来昔布，对各组分别进行Westernblot、I免疫荧光染色，观察神经干细胞的增殖情况、细胞周期蛋白CyclinD1的表达情况以及Wnt/β-Catenin信号通路相关蛋白GSK-3β、β-Catenin等的表达。第三部分：1、动物实验：将C57BL/6J小鼠合笼配对后，选合适孕鼠随机分为：对照组、塞来昔布组、姜黄素组以及塞来昔布+姜黄素组，对照组在胎龄16.5

5、天和17.5天时分别给予生理盐水10ml/kg灌胃，塞来昔布组在相同时间给予含有30mg/kg塞来昔布的生理盐水10ml/kg灌胃，姜黄素组在胎龄13.5至16.5天时每天给予500nmol/kg姜黄素腹腔注射，并给予前述等量生理盐水灌胃共2次，塞来昔布+姜黄素组同时给予前述等量的塞来昔布和姜黄素。取胎鼠前额叶皮质进行免疫荧光染色和Westernblot，观察新生神经元的数量、神经干细胞的增殖情况、细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达以及Wnt/β-Catenin信号通路的活性。2、细胞实验：将胎龄16.5天的C57BL/6J小鼠脱颈处死，取胎鼠前额叶皮质，分离培养神经元和神经干细胞，然后分

6、别分为：对照组、塞来昔布组、姜黄素组以及塞来昔布+姜黄素组，对照组将细胞置于DMSO溶液中48小时，塞来昔布组的DMSO溶液中含有浓度为50μM的塞来昔布，姜黄素组的DMSO溶液中含有浓度为20μM的姜黄素，对于姜黄素+塞来昔布组，在DMSO溶液中加入塞来昔布前2小时加入姜黄素。对各组分别进行免疫荧光染色和Westernblot，观察神经元轴突形态、神经干细胞增殖情况、细胞周期和相关蛋白表达、Wnt/β-Catenin信号通路活性等。结果：1、塞来昔布减少胎鼠新生神经元数量，但不影响神经元形态，并能够减少进入+细胞周期的神经干细胞数量。动物实验的免疫荧光结果中，塞来昔布组的Tbr1新生神经元数

7、量明显较少，而细胞实验中Drebrin染色下对照组和塞来昔布组的神经元轴突形态没有明显变化，动物实验和细胞实验的结果均表明，Pax6染色的神经干细胞对照组和塞来昔布组没有明显区别，BrdU染色的神经干细胞塞来昔布组明显降低，而BrdU染色阳性细胞代表的是处于细胞增值活跃期的神经干细胞，因此塞来昔布对于神经干细胞总量没有明显影响，但干扰了神经干细胞进入细胞周期。2、塞来昔布主要通过抑制Wnt/β-C