miR-135b活化AKT、STAT3途径抑制索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡.pdf

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1、分类号：R735.7密级：公开学校代码：11065学号：y0115130138博士专业学位论文miR-135b活化AKT、STAT3途径抑制索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡作者姓名高艳芳指导教师梁军教授专业领域肿瘤学培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月19日miR-135b活化AKT、STAT3途径抑制索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡摘要目的：我国是肝癌高发区，全球每年一半以上的新发病例在中国，因缺乏有效的全身治疗药物，使得肝癌的预后极差，目前迫切需要研究开发出更有效的方法来治疗肝癌。miR-135b是新近发现的一种microRNA，目前研究发现其与多种恶性肿瘤的发生、发展、预后及化放疗的敏

2、感性等有关。但有关miR-135b在肝癌中的表达情况、作用机制及其是否与肝癌细胞耐药的产生、药物敏感性等有关还知之甚少。因此本研究的目的首先明确miR-135b在常见肝癌细胞株中的表达水平。观察肝癌细胞株内稳定过表达miR-135b后肝癌细胞增殖、迁移、侵袭以及药物敏感性的变化。探索miR-135b过表达后引起索拉非尼耐药的主要原因和机制，并探讨应用特异性小分子抑制剂逆转索拉非尼耐药的可能性。方法：1．实时荧光定量PCR选取Bel-7402、HepG2、MHCC97和SMMC-7721等4种不同的肝癌细胞株进行培养，用Trizol提取RNA，逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用RT

3、-PCR技术检测4种肝癌细胞株中miR-135b的相对表达水平。2．过表达miR-135b的慢病毒载体的构建及细胞的转染应用PCR将前miR-135b的序列从人基因组中扩增出来后，构建到慢病毒载体pLenti-CMV-GFP-puro中，同时以空载体作为阴性对照，酶切后应用Sanger测序技术确认序列正确以后，转化到大肠杆菌DH5α中，大量扩增后进行质粒抽提，去除内毒素，调整质粒浓度为1μg/μl。与包装质粒△8.92和VSVG按照10:10:1质量比，利用商品化脂质体转染到293T细胞中，48和72小时后收集培养基上清，所得大量慢病毒颗粒联合polybrene以后转染SMMC-772

4、1细胞，转染72小时以后应用荧光倒置显微镜观察细胞中miR-135b的转染效率。使用puromycin筛选稳定表达miR-135b的SMMC-7721细胞株。荧光定量PCR检测转染后的肝癌细胞中miR-135b的表达水平，实验组标记为lenti-miR-135b，空载体对照组标记为lenti-Vector。3．MTT实验将处于对数增长期的待检测细胞加到96孔板中，细胞密度为1×105cells/ml，每个时间点设置5个复孔，在1、3、5、7天时分别进行MTT测定。选择570nm波长，酶联免疫仪上测定吸光度A值，计算细胞增殖率。4．软琼脂克隆形成实验I取6孔板，应用低熔点琼脂糖配置下胶，

5、先铺下胶，待稍微凝固以后，取对数生长期的细胞，按照1万细胞/孔加入6孔板中，然后铺上胶，凝固后加入少许培养基，培养2-3周之后，放置在倒置显微镜下进行克隆计数。5．划痕实验用marker笔在6孔板背后均匀得划横线，每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×105个细胞。待孔内的细胞完全长满以后，用10μl枪头尽量垂直于背后的横线划痕。PBS冲洗3次去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃、5%CO2培养箱培养，按0、12、24小时取样拍照，计算划痕宽度，值越低表示细胞迁移能力越强。6．侵袭实验将lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞加入Transwell小室。加入1

6、00μl细胞悬液使得小室内细胞数量为1-10万个细胞。加入含有10%FBS的DMEM/F12培养液培养24h，结晶紫染色30min。用PBS洗2遍后显微镜下观察。计数镜下染色阳性细胞数，阳性细胞数越多说明侵袭能力越强。7．药物敏感性实验在lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞中分别加入常用的抗肿瘤药物包括紫杉醇、顺铂、奥沙利铂和索拉非尼，孵育48小时后，MTT法计算IC50值，比较两组细胞对不同药物敏感性的差异。8．细胞周期及细胞凋亡的检测经索拉非尼处理lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞48小时后，冷甲醇固定细胞，应用PI单染细胞后，应用

7、流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，通过软件计算各时相的百分比。同样的方法处理细胞后，应用AnnexinV/PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率变化情况。9．免疫印迹实验不同浓度索拉非尼分别作用lenti-miR-135b和lenti-Vector组细胞，RIPA裂解液裂解细胞后，收集两组细胞蛋白，SDS-PAGE电泳以后，免疫印迹法分别检测MAPK、AKT、STAT3等蛋白及其磷酸化形式的表达情况。10．移植瘤模型的建立在24只裸鼠右前肢皮