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1、博士学位论文论文题目小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径研究生姓名曹蓓蓓指导教师姓名彭聿平专业名称人体解剖与组织胚胎学研究方向神经免疫调节论文提交日期2013年3月基金资助：国家自然科学基金面上项目：30870819江苏省自然科学基金项目：BK2010278南通市应用研究计划项目：K2009047小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径中文摘要小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径中文摘要目的：我们实验室以前的研究表明小脑顶核可参与调节淋巴细胞功能。由于小脑与免疫系统之间没有直接的结构上的联系，因此探讨小脑调节免疫功能的途径和机制对于更好地理解小
2、脑的免疫调节功能具有重要的意义。下丘脑是中枢神经系统中重要的免疫调节中枢。为此，本研究一方面进一步揭示小脑顶核至下丘脑的神经投射路径及性质；另一方面，在上述研究的基础上分别研究小脑顶核至下丘脑γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）能和谷氨酸能神经投射对淋巴细胞功能的影响，以探讨小脑顶核调节免疫功能的中枢和外周途径，进一步拓宽和加深对小脑神经免疫调节的认识和理解。方法：1.单侧小脑顶核内微量注射葡聚糖-德克萨斯红（Texasreddextranamine,TRDA），顺行追踪顶核至下丘脑的神经投射路径及终止部位。单侧下丘脑外侧区（
3、lateralhypothalamicarea,LHA）内微量注射逆行追踪剂红色荧光金（Fluoro-Ruby,FR），结合GABA和谷氨酸免疫荧光组织化学染色，进一步确定顶核至下丘脑投射的性质。2.双侧小脑顶核内微量注射GABA降解酶—GABA转氨酶的抑制剂氨已烯酸（vigabatrin,VGB）或GABA合成酶—谷氨酸脱羧酶的抑制剂3-巯基丙酸（3-mercaptopropionicacid,3-MP），并以未作任何处理的空白大鼠和双侧小脑顶核注射等量生理盐水的大鼠作为对照。注射后第3天，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（carboxylfluoresce
4、insuccinimidylester,CFSE）和抗CD3抗体流式双标技术检测T淋巴细胞对刀豆蛋白A（concanavalinA,ConA）刺激的增殖反应；用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测血清中抗绵羊红细胞（sheepredbloodcells,SRBC）特异性IgM抗体水平；动物于第6天加强注射药物，3天后用CAM/EH-1流式双标技术检测脾脏自然杀伤（naturalkiller,NK）细胞杀伤肿瘤靶细胞I中文摘要小脑顶核调节免疫系统功能的中枢和外周途径YAC-1的活性。在检测淋巴细
5、胞功能的同时，用FR逆行追踪结合GABA免疫组化染色检测顶核至LHA投射中GABA能神经元数目的变化，并用高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）检测下丘脑中GABA的含量变化。3.大鼠用小牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）进行免疫。免疫后第3天，双侧小脑顶核内微量注射谷氨酸合成酶—谷氨酰胺酶的抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxo-L-norleucine,DON），同时双侧LHA或丘脑腹外侧核（ventrolateralthalamicn
6、uclei,VL）内微量注射谷氨酸膜转运体抑制剂苏式-3-羟基天冬氨酸（D,L-threo-β-hydroxyasparticacid,THA）。动物饲养3天，用抗CD3，CD4，CD8，CD45RA和NKR-P1A抗体标记流式检测外周血中T细胞及其亚群，B细胞和NK细胞的百分比变化；用CD3/CD25和CD3/CFSE流式双标技术分别检测肠系膜淋巴结T细胞对ConA刺激的活化和增殖能力；用real-timePCR法检测淋巴结T细胞中细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-5，IL-10，TGF-β，IL-22，IL-17mRNA的表达及用ELI
7、SA法检测细胞培养上清中细胞因子IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β，IL-22，IL-17的水平。此外，大鼠B细胞抗BSAIgM和IgG抗体生成能力及脾脏NK细胞的杀伤活性也分别用ELISA法及流式细胞术进行检测。在检测上述淋巴细胞功能的同时，同样用FR逆行追踪结合谷氨酸免疫组化染色检测顶核至LHA投射中谷氨酸能神经元数目的变化，以及用HPLC法检测下丘脑及丘脑组织中谷氨酸含量的变化。4.注射DON及THA后第3天，用ELISA法检测血清中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropichormone,ACTH），皮质醇（c
8、ortisol），促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone,TSH），
