猕猴骨髓间充质干细胞和去细胞神经优化人工神经构建

《猕猴骨髓间充质干细胞和去细胞神经优化人工神经构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建杨光诗中文摘要捕要【目的】周围神经损伤的修复是医学界的一个难题，一直缺少一种良好的修复方法。现代化交通和机械化的迅速发展使周围神经损伤的发病率不断上升，自体神经移植因含有适合神经再生的微环境而成为周围神经损伤的最佳修复方法。但其来源有限．且供区会出现新的感觉和(或)运动功能损失。因此，治疗长段或粗大神经缺损的是临床一大难题。很多学者在寻找用非神经移植物(如：骨骼肌及其基膜管、肌键、硅胶管等)来解决修复周围神经缺损的问题。然而这些非神经移植体由于不具备自体神经的结构和功能，无法形成神经再生的微环境，治疗效果差。因此，迫切需

2、要研究结构和功能都类似自体神经替代物。随着细胞生物学和材料科学的发展，形成了新的边缘学科，即组织工程学。其基本原理是将体外培养的种子细胞吸附于支架上，构建出新的组织或者器官。目前已经在人工软骨、骨、肌腱、皮肤、人工肝和人工胰等方面取得进展。在人工神经方面1。2’“。，经过国内外学者的努力，已取得一些成果。理想的人工神经移植体内部结构应该模拟天然周围神经结构，而种子细胞能够通过定向分化和分泌各种神经营养因子形成类似的神经结构和适合神经再生的微环境促进神经再生。按组织工程原则，本实验室近几年对人工神经的构建进行了比较系统研究，从支架材料和种子细胞两个方面着手优化人工神经移植

3、物(一)：利用化学萃取剂处理同种异体神经以最大可能的去除掉其免疫原性，用其作为细胞支架：同时还进行了人工材料的生物相容性和降解性以及制作三维支架等方面的研究；(二)：在种子细胞方面我实验室等主要进行了雪旺细胞作为种子细胞的研究，同时还进行了雪旺细胞在三维支架中的粘附、排列、生长等方面的研究。本实验室曾经用雪旺细胞作为种子细胞构建的人工神经来修复神经缺损进行了研究，取得了一定的效果。但是，我们在研究中也发现雪旺细胞作为种子细胞的不利因素：(一)：由于免疫原性雪旺细胞必须是取自体的，这样必然要牺牲自体神经，从而造成供区的功能损失，限制了其应用；(二)：体外培养的雪旺细胞随着

4、时间的延长其生命力逐渐下降导致其作用的发挥下降。基于上述考虑，我们设计猕猴骨髓间充质干细胞(MSCs：mesenchymalstemcells)‘“作为种子细胞种植于化学萃取同种异体神经优化人工神经构建人工神猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建杨光诗中文摘要经移植体。由于化学萃取的猕猴同种异体神经可去掉其免疫原性，同时还具备适宜神经再生的微结构。因此我们从人工神经的以上两个主要因素即种予细胞和人工支架来优化人工神经，利用猕猴前臂的尺神经来进行体内外的科学研究。【方法】(一)、细胞培养：采用剃度离一tl,的方法培养猕猴骨髓间充质干细胞。1⋯，由于其具有较强的

5、自我增殖能力，从而可以在较短的时间内培养出大量的骨髓间充质干细胞，能够为人工神经的构建提供必需的种子细胞，(二)、去细胞猕猴同种异体神经：利用Triton．X-100和脱氧胆酸钠液采用化学萃取的方法去除掉异体神经的主要免疫成分一雪旺细胞及髓鞘结构等：萃取好的异体神经放入PBS液44C保存备用对上述萃取一次和两次的神经行HE染色、S-100免疫组化、纤维素染色及砂罗铬花青染色及透射电镜和扫描电镜检测，了解萃取结果：(三)、猕猴骨髓闻充质干细胞种植于去细胞同种异体神经构建人工神经的体外研究：在10倍显微镜下用10微升微量加样器把一定数量的第三代猕猴骨髓间充质干细胞按106／

6、ml的浓度种植到化学萃取同种异体神经，注射时用微量加样器的针头纵行穿刺入化学萃取同种异体神经，边注射边退出针头，会发现白色的化学萃取同种异体神经逐渐膨胀并变为粉红色(因为细胞培养基的颜色为粉红色)，把注入细胞的化学萃取同种异体神放入含有培养基的六孔培养扳中培养，并于立刻及第3及第5天行HE染色检测了解细胞的分布情况：(四)、猕猴骨髓间充质干细胞种植于去细胞同种异体神经构建人工神经的体内研究：在2．3岁猕猴肘关节远端ICM处为起点向远端切除4CM神经，造成神经缺损，并采用以下三种方式进行修复：(J)猕猴骨髓间充质干细胞种植于化学萃取同种异体神经构建的人工神经：(2)细胞培

7、养基注射入化学萃取同种异体神经构建的人工神经：(3)自体神经移植三组均于术后6个月行电生理及组织学HE和NF免疫组化检测【结果】(一)．经上述密度剃度离心法培养的骨髓问充质干细胞原代大约需要1l到12天，行第一次传代，以后的传代细胞大约需4到5天，行第二、第三、第四等II猕猴骨髓间充质干细胞与去细胞神经优化人工神经的构建杨光诗中文摘要依次传代随着传代次数的增加，细胞形态均一性提高，在相差显微镜低倍下观察细胞呈旋涡状生长，细胞呈长梭状，一般有两个突起，部分细胞有三个甚至更多的突起，有的细胞会看到正处在核分裂状态：(二)化学萃取猕猴同种异体神