构建永生化的人骨髓间充质干细胞

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1、摘要目盟：构建永生化的人骨髓间充质干细胞．友法：采用阳离子脂质体介导法将病毒质粒pBabepuro-hTERT导入包装细胞内，嘌岭霉素(Puro)筛选出病毒表达阳性的细胞克隆，测定病毒滴度。取培养病毒的上清液感hBMSCs细胞、筛选出转基因细胞，我们将其命名为hTERT-hBMSCs细胞。采用端粒酶重复序列扩增(telomereAtrepeamplificationprotocolassay，TRAP)酶链免疫吸附试验(ELISA)法检测hBMSCs细胞转染前后端粒酶活性的变化；采用MTT法(四甲基偶氦唑盐微量酶反应比色法)测绘转染前后细胞生长曲线，观察hTERT转入后对细胞增殖的影响；

2、克隆形成实验检测hTERT-hBMSCs细胞的增殖能力：染色体核型分析观察}rrERT-岫MsCs细胞染色体是否正常；成骨试剂盒检测h1’ERT-IlBMSCs细胞向成骨分化的能力。绪墨：骨髓问充质干细胞为贴壁生长的梭形细胞，表面抗原ClM4表达阳性，CD34阴性。TRAP—ELISA法检测转染hTERT的hBMSCs细胞的端粒酶为阳性，而未转录的正常人的hBMSCs细胞则为阴性，说明转入hTERT基因后细胞端粒酶激活。hTER丁-hBMSCs细胞比labMSCs细胞增殖活跃，两组相比有显著的差异性，目前已传了ll代，尚未见衰老迹象。染色体核型分析所示：hTERT-hBMSCs细胞染色体

3、数目和结构正常，未见缺失、断裂、异位等畸变。成骨诱导结果表明hTERT-hBMSCs细胞仍具有向成骨分化的能力。克隆形成实验结果显示hTERT-hBMSCs细胞的克隆形成率较低，为0．66％，为正常细胞。结论：导入外源性hTERT可激活细胞端粒酶的活性。hTERT基因转入细胞后，不影响其生物学特性和分化功能，仍然保持向成骨分化的能力。关键词：骨髓间充质干细胞，端粒酶催化亚基，永生化论文类型：B(应用研究)Abstractobj∞tive：construcfioninnnortalizedhumanBoneMesenchymalsterncells．—Meth—ods：HBMSCscell

4、swereinfectedbytheretroviralparticles(pBabepuro-hTERT)，andthenthedesignedhTERT-11BMSCscellswere∞IectedbyptIromycin．Thetclomeraseactivity,thecellsgrowthcurveandChromatosomekayotypeofhTERT．hBMSCscellswe他detectedbvTRAP(PCR)-EL[SAandMTTrespectively．Then．thehTERT．hBMSCscellswereinducedintoosteoblastby

5、NHOsteoDifrMediumandtheALPwasdetectedbyimmunocytechemicalstaininginhTERT-11BMSCscells．Finally,proliferationcapacityofhTERT-hBMSCseelIswereobservedbytherateofcolonyformation．—Resu—lts：hBMSCscellswereattachedtothesurfaceofflaskswithspindle—shapedorfibrocyte-likeshape．ThephenotypeofhTERT．hBMSCsWasCD

6、44positiveandCD34negative．ThetelomeraseactivityofhTERT-hBMSCscellsWaspositive．ThegrowthspeedofhTERT．hBMSCscellswerehigherthanthoseofhBMSCscellsmeesuredbyMTTasSay．ThegrowthspeedOfhBMSCscellswereslowerthanthoseofhTERT．hBMSCscellsunderthesameconditions．Presentlyithadpropagatedelevengenerations．butth

7、eydidn’texhibitsenescentphenomenon．Theanalysisofc11romatosomeofhTER下hBMSCscellsshowedthatchromatosomewerenoma’diploid．ThehTEfU’．hBMSCscellsmaintainedtheirdifierentiationalcapabilitywhichprovedbyinducedtoosteoblastinvit