马耳他布氏菌弱毒疫苗m5-90外膜蛋白bp26和omp31抗原表位及其疫苗免疫评价

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文马耳他布氏菌弱毒疫苗M5．90外膜蛋白BP26和OMP31抗原表位及其疫苗免疫评价AntigenicEpitopesofoutermembraneproteinBP26andOMP31ofattanuatedvaccineBrucellamelitensisM5．90Strainandtheirevaluationofvaccination课题来源：国家973计划项目(2010CB530204)；国家自然科学基金(31100657)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院吴静波黎诚耀教授免疫学学术

2、型硕士研究生生物技术学院2013年5月7日广州f嘲㈣硕士学位论文～～马耳他布氏菌弱毒疫苗M5．90外膜蛋白BP26和OMP31抗原表位及其疫苗免疫评价硕士研究生：吴静波指导老师：黎诚耀教授背景：摘要布鲁氏菌在我国为乙类病原微生物，主要引起布鲁氏菌病，简称布病，是目前世界上流行最广、危害最大的人兽共患病之一。布病可引起动物的流产和不孕，引起人急性波状热等，容易转入慢性引起肝脾、淋巴结肿大，关节炎等变态反应性疾病。有部分病例表明布病可导致孕妇流产，甚至还出现母婴垂直传播。据统计资料表明，全世界每年约有50万人感染布鲁氏菌病，每年因该病造成的经济

3、损失近30亿美元，而中国处于人间布病发病率超过1／10万的国家之一，为布病“重灾区”国家，主要威胁宁夏、新疆、浙江、山西、甘肃、辽宁、上海、青海、河北、江苏等约28省。据中国CDC报告，2005-2008年全国布病新发病人分别为18416、19013、21901、30002例，2006年、2007年发病数上升到全国甲类、乙类传染病发病数顺位的第10位。2009年(37734例)发病人数超过3．5万，达历史新高。但2012年最新CDC的统计报告显示发病人数已接近4万，至39875人，以平均每年10％的速率上升，赫然成为最严重的公共卫生问题之一

4、。在人感染布菌中，80％以上是通过接触感染羊及其产品导致的。因此，预防人的布病首要是预防羊布菌感染。布鲁氏菌是一种能引起变态反应的兼性胞内寄生菌，主要寄生在一些专职和非专职吞噬细胞中，如巨噬细胞和上皮细胞等。据不完全统计，世界上有近摘要60种野生动物对布鲁氏菌侵袭可产生各种血清学反应，近30种野生动物身上寄生了各生物种的布鲁氏菌。在我国流行的主要为羊、牛、和猪种，羊种(B．melitensis)占流行株80％，牛种假abortus)占10％，猪种佃．suis)不到1％。丑melitensis是绵羊和山羊的致病菌，也是对人毒力最强、危害最大的

5、亚种。布鲁氏菌病临床症状复杂，引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆；医生很难单凭有无病畜接触史来诊断布氏菌感染，给诊断带来了一定的困难，容易导致误诊，造成慢性感染。另一方面缺乏有效的治疗手段，抗生素的大量长期使用仍很难见效，且容易引起耐药性问题。因此，布鲁氏菌的疫苗预防和早期快速诊断对布菌的防控具有重大的现实意义；其中疫苗的免疫效果和布菌诊断的准确性就显得尤为重要。预防布病的疫苗，必须能有效诱导以产生IFN-，l,为特征的Thl型细胞免疫反应，尤其是CTL介导的细胞毒效应。羊种布菌疫苗M5．90是我国自主研发用于绵羊和山羊接种的减

6、毒活疫苗，免疫效果相对较好。但是缺乏其在天然宿主羊免接种后，体液和细胞免疫反应水平及免疫保护效果的相关研究，并且M5．90疫苗株也存在两个缺陷：一是免疫动物与自然感染动物不能区别，严重影响了布病的诊断和检疫；二是疫苗毒力较强，可引起部分孕畜流产。因此，研制一种新型的毒力低、免疫效果好、能进行鉴别诊断的分子标记疫苗势在必行。目前，国内外倾向于采用基因工程的手段对布菌现有疫苗进行改造。国外曾有研究报道了羊种布菌疫苗株Rev．1BP26基因缺失株(CGV26)并发现其仍具有免疫保护效果。但是，国内研究人员对M5．90菌株进行改造，敲除BP26得到

7、新的突变株M5A61,26，其毒力有所下降，但免疫应答弱于原疫苗株，持续时问短，免疫效果达不到要求：相似的情况还出现在Rev．1的omp31缺失株中。由此推断，BP26和OMP3l蛋白可能与疫苗株毒力和保护性抗原相关，若将M5．90疫苗株携带的BP26基因全部敲除，则影响弱毒疫苗株的免疫效果。BP26蛋白是布菌的一种外膜问质蛋白，在布菌多数亚种中具有高度的保守性。在感染的牛，绵羊，山羊和人中是一种免疫显性优势抗原，可作为动物和II硕士学位论文人布病的诊断抗原，准确率可达到86％以上。OMP31为膜孔蛋白，其基因序列在不同的种属之间的同源性高

8、达98％以上，在牛种茵中缺失，在羊种和猪种之间存在大约9个核苷酸的差异，并存在氨基酸序列的改变，故OMP31的单克隆抗体可能能够鉴别诊断不同生物型的布鲁氏菌感染。因此，我们设想在