重组马耳他布鲁菌omp31蛋白用于间接elisa诊断抗原的研究

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1、分类号S813.3学校代码10129UDC636学号2009201104重组马耳他布鲁菌OMP31蛋白用于间接ELISA诊断抗原的研究RecombinantOMP31ProteinsofBrucellMelitensisStrainUsedastheDiagnosticAntigeninIndirectELISATest申请人：吴杰学科门类：农学学科专业：临床兽医学研究方向：反刍动物抗病性能研究指导教师：吴树清教授论文提交日期：二〇一二年五月摘要本研究是对马耳他布鲁菌omp31基因进行原核表达，并建立了以重组OMP31蛋白，作为间接ELISA方法的

2、检测抗原，检测阳性血清中因感染牛种布鲁菌而致病的血清。主要研究结果如下：1.布鲁菌omp31的原核表达与抗原性检测采用聚合酶链反应技术(PCR)从内蒙古分离的马耳他布鲁菌扩增得到布鲁菌omp31基因片段并插入PMD18-T载体克隆测序,将目的基因插入原核表达载体pET-30a中，转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,用SDS-PAGE和western-blot检测该蛋白。结果成功构建了重组质粒pET-30a-omp31并在大肠杆菌中，成功表达了omp31基因,重组蛋白能与马耳他布鲁菌阳性血清发生特异性反应。2.间接ELISA法检测牛种布鲁菌病的

3、建立及应用以重组OMP31蛋白作为包被抗原，筛选确定了间接ELISA检测方法的最佳反应条件。重组OMP31蛋白最佳抗原包被浓度为2.5µg/ml(稀释800倍);血清的稀释度为100倍;封闭液为1%BSA，于37℃封闭2h;酶标二抗反应条件为1:5000倍稀释;OMP31蛋白包被孔的阴、阳性临界值为0.337。特异性结果显示，OMP31蛋白包被孔与免疫S19疫苗的牛、羊阳性血清和标准牛、羊阴性血清不发生交叉反应。ELISA的重复性实验重组OMP31蛋白包被孔的批内与批间检测结果的变异系数均低于10%。以上结果显示，该间接ELISA方法有很好的重复性

4、，特异性，敏感性，因此可以作为血清学方法来诊断有牛种布鲁菌感染的布鲁菌病。关键词：布鲁菌；omp31；原核表达；ELISARecombinantomp31ProteinsofBrucellMelitensisStrainUsedastheDiagnosticAntigeninIndirectELISATestAbstractInthisstudy,recombinantomp31proteinofBrucellmelitensisstrainwasexpressedfordevelopingindirectELISAforBrucellabortu

5、sstraindifferentialdiagnosis.Themainresultswereasfollows:1.Expressionandimmunogenicityoftherecombinantomp31proteinBrucellmelitensisstrainTheomp31geneweregotfromBrucellamelitensisisolatedininnermongoliabyPolymerasechainreaction(PCR)andclonedintoPMD-T.Aftersequencing,theomp31gen

6、ewereclonedintovectorpet-30aandexpressedinEcoli,thendetectedbySDS-PAGEandwestern-blot.Therecombinantplasmidpet-30a-omp31wasconstructedsuccessfullyandexpressedsuccessfullyinEcoli.TherecombinantproteincouldreactwithBrucellamelitensispositiveserum.2TheEstablishmentofIndirectELISA

7、fordetectingbrucellosisinfectedbyBrucellabortusstrainTheindirectELISAwasdeveloppedbytherecombinantOMP31antigen.TheoptimalresultofELISAasfollow:coatingconcentrationwas2.5µg/ml(1/800).Theoptimaldilutionofserumexaminedwas1/100;1%BSAwasdeterminedtobethebestblockingreagentofantigen

8、,TheoptimaldillutionofHRPwere1:5000forELISA;Thecut-offOD450va