细胞内钙超载在腺苷(adenosine)致肝癌细胞凋亡作用机制研究

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1、汕头大学医学院硕士学位论文硕士学位论文细胞内钙超载在腺苷(Adenosine)致肝癌细胞凋亡题题题目目目作用机制研究2+AdenosineinducesCa-mediatedapoptosisinHepG2英文题目cells姓名张庆华学号11020077所在学院汕头大学医学院导师姓名吴灵飞教授专业内科学入学日期2010年年年9月月月答辩日期2013年年年5月月月I汕头大学医学院硕士学位论文学位论文原创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个

2、人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。作者签名：导师签名：日期：年月日日期：年月日II汕头大学医学院硕士学位论文摘要研究目的:2+探讨腺苷（Adenosine,ADO）诱导人肝癌He

3、pG2细胞凋亡及其与Ca相关的机制。材料和方法材料和方法：材料和方法：：：HepG2细胞培养后按以下方法进行实验:①CCK-8法检测细胞增殖活性：细胞传代至96孔板中，待细胞贴壁后分别用含不同浓度ADO(0-6.0mmol/L)的培养基处理HepG2细胞24h、36h及48h，然后利用CCK-8法测定ADO对HepG2细胞增殖活性的效应。②DAPI染色检测细胞凋亡：细胞传代至盖玻片上，待细胞贴壁后将HepG2细胞暴露于不同浓度的ADO（0-4.0mmol/L）作用24h，DAPI染色后在荧光显微镜下观察细胞核的形态学改变。③AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

4、率：细胞贴壁后加入正常培养基（空白组和对照组）及ADO（处理组）作用细胞24h，流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡情况。④Fura-2AM2+及Fluo-4AM检测细胞内游离Ca浓度：ADO处理组与正常对照组培养细胞24小时后，分别用荧光分光光度法检测Fura-2AM染色及共聚焦显微镜下检测Fluo-4AM染色，比较ADO处理前后细胞内钙离子浓度变化。⑤荧光定量PCR（RT-qPCR）检测相关因子mRNA表达：提取ADO（0-4.0mmol/L）作用24h后细胞总RNA，RT-qPCR法检测凋亡相关通路m-calpain,Caspase-4,Bax,Bak及Caspase-3

5、的mRNA水平的表达；⑥免疫印迹法检测蛋白表达：ADO（0-4.0mmol/L）处理HepG2细胞24h，提取细胞总蛋白，Westernblot检测上述通路中相关蛋白的表达。⑦通过罗丹明123（Rho123）染色ADO处理前后的HepG2细胞利用流式细胞术检测ADO（0-4.0mmol/L）处理24h前后细胞线粒体膜电位（∆Ψm）变化。结果1、观察不同浓度ADO分别处理HepG2细胞24h、36h及48h后对其细胞的增殖抑III汕头大学医学院硕士学位论文制作用:CCK-8法检测结果显示，随ADO浓度增加或作用时间延长，ADO处理组吸光值（OD值）减少，与对照组相比，差异有显

6、著性（P<0.05），表明ADO抑制了肝癌HepG2细胞增殖。2、不同浓度的ADO作用HepG2细胞24h后，荧光显微镜下观察DAPI染色后细胞核形态，正常细胞的细胞核呈圆形，淡蓝色；ADO处理后，染色质凝固、凝集，有典型的“凋亡小体”出现，这种凋亡特征的细胞呈剂量依赖性增加。3、AnnexinV-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测显示，随着ADO处理剂量的增加，细胞凋亡率逐渐升高，呈现出一定的剂量依赖性关系，表明ADO是通过诱导细胞凋亡抑制细胞增殖。4、分别用荧光分光光度法及共聚焦显微镜观察细胞内钙离子浓度变化，结果表明不同浓度的ADO（0-4.0mmol/L）处理H

7、epG2细胞24h后，Fura-2AM染色后显示细胞内游离钙离子浓度呈上升趋势(F340/F380比值升高，差异有显著性，P<0.05)；Fluo-4AM染色后于共聚焦显微镜下可检测到细胞内荧光强度明显升高。5、RT-qPCR和Westernblot检测结果显示，与对照组相比，不同浓度的ADO（1.0-4.0mmol/L）处理HepG2细胞24h后，细胞内钙依赖蛋白m-calpain、内质网相关蛋白Caspase-4、Bcl-2家族促凋亡蛋白Bax、Bak及凋亡执行蛋白Caspase-3表达上升；与对照组比较均有统