大叶补血草na-%27%2b-%2fh-%27%2b-逆向转运蛋白基因克隆和功能初步的研究

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1、摘要植物的盐胁迫主要是由Na+引起，过高的Na‘浓度会引起渗透胁迫、离子毒害和IC／Na+比率的不平衡，致使植物的新陈代谢异常，从而对植物细胞造成伤害。Na+／H’逆向转运蛋白催化Na+和H+的跨膜逆向运输，是植物抵御盐分胁迫的一种主要方式，对植物的耐盐性有重要作用。本研究的主要目的是从盐生植物大叶补血草(Limoniumgmelinii(Willd．)Kuntze)中克隆液泡膜和质膜Na+／H+逆向转运蛋白基因(LgNttXl和￡吕记箩Z)，构建由组成型启动子CaMV35S驱动的植物表达载体。

2、通过农杆菌介导，将LgNttXl基因和LgSOSl基因转入模式植物烟草中，以确证它们的功能。目前，取得的研究结果有：1．本文比较了GenBank中已登录的多种植物液泡膜Na+／H4逆向转运蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列，根据保守序列设计一对简并引物，通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物大叶补血草中克隆出Na+／H+逆向转运蛋白基因的全长eDNA，该cDNA全长2397bp。序列分析其含有一个完整的1656bp的开放读码框，512bp的5’端非翻译区，229bp的3’非翻译区，其中包括12个b

3、p的poly(A)尾巴。将其命名为LgNItXl。该cDNA全长在GenBank中的登陆号为EU780457。2．用DNAman分析软件对』删编码蛋白分析表明，LgNHXl含有550个氨基酸残基，推测分子量为61KD。LgNHXl含有液泡膜Na’／H’逆向转运蛋白共有的高度保守序列氨氯吡嗪嘧的结合位点(LFFIYLLPPI)。LgNHXl的氨基酸序列与植物中己经报道的北滨藜(Atriplexgmelini)、小麦(Triticumaestivum)、盐角草(Salicorniaeuropaea)

4、、盐地碱蓬(Suaedasalsa／)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)的Na+／H+逆向运输蛋白同源性很高，分别为82．62％，82．01％，80．64％，79．86％，75．86％，表明它是植物中比较保守的一种基因。疏水性分析表明，LgNHXl的N末端为一疏水结构，可能由11-12个跨膜结构域组成，且跨膜区是高度保守的。系统发育分析可知，LgNHXl与液泡型的Na+／H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近，表明LgNHXl是定位于液泡膜上的Na’／H+逆向转运蛋白。3．采用常规分子克

5、隆技术，构建了将LgNttXl编码框正确插入至表达载体pCAMBIA1301相应位点的植物表达载体pCAMBIA1301一LgNtIXl。用冻融法将该表达载体转化农杆菌GV3101，通过浸染转化烟草，筛选出具有潮霉素抗性的遗传转化植株。经PCR、Southern印迹分析和RT—PCR检测，初步证实LgNItXl基因已整合至烟草基因组中。4．用不同浓度的Nacl溶液处理转基因植株和对照植株，在高浓度的盐胁迫下(300mmol／L)，转基因植株根和叶中的K+／Na+比和叶片叶绿素含量显著高于对照植株

6、，而叶片的相对电导率和丙二醛含量显著低于对照植株，说明LgMIXl在转基因植株中得到了表达，转基因烟草的耐盐性得到了一定程度的提高。5．本文比较了GenBank中已登录的多种植物质膜型Na+／H+逆向转运蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列，根据保守序列设计简并引物，通过RT—PCR及RACE的方法从盐生植物大叶补血草中克隆出Na‘／H+逆向转运蛋白基因的全长cDNA，该cDNA全长3910bp，序列分析其含有一个完整的3455bp的开放阅读框(ORF)，79bp的5’一端非翻译区(UTR)，376bp

7、的3’一端非翻译区(UTR)，其中包括11个bp的poly(A)尾巴。将其命名为LgSOSl。，提交GenBank登录号EU780458。6．用DNAman分析软件对三g筋』编码蛋白分析表明，大叶补血草Na+／H+逆向转运蛋白含有1151个氨基酸残基，推测分子量为126KD。LgSOSl的氨基酸序列与植物中已报道的冰叶午时花(MesembryanthemumcrystaJlinure)、沙拐枣(Populuseuphratica)、番茄(Lycopersiconesculentum)、盐芥(Th

8、ellungiellahalophila)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)的Na4／H+逆向转运蛋白具有较高的同源性，分别为69．02％，64．42％，61．96％，60．12％，59．62％。疏水性分析表明，LgSOSl的N末端为一疏水结构，可能由ll一12个跨膜结构域组成。蛋白质比对结果表明，LgSOSl跨膜区的氨基酸序列与其他植物的Na+／H+逆向转运体之间存在很高的相似性。系统发育分析可知，LgSOSl与质膜型的Na+／H+逆向转运蛋白的亲缘关系较近，而与液泡型的Na+