人肝脏相关cona和dsa结合型糖蛋白组学的研究

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1、论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：论文使用授权声明日期本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：——导师签名：——日期：博士葡f究生论主人肝耻相关ConA和DSA结合

2、塑麓置自组学研究中文摘要第一部分人健康肝刀豆凝集素fc明A)结合型糖蛋白组学研究[}鸯要】目的；随着蛋白组学研究领域的急剧扩展。糖蛋白糖链结构与功能的研究是当前蛋白质组学发展后的重要延伸领域。在此我们选用可以识别二天线型和高甘露糖型结构的刀豆凝集素ConA通过固相亲和层析的富集糖蛋白，通过双向电泳、质谱技术来建立相对稳定、标准的高通量糖蛋白质组学共性技术平台．建立和分析人健康肝组织刀豆凝集素ConA结合型糖基化蛋白质数据库，为后续工作奠定了基础。方法；从人健康肝组织中提取总蛋白，通过刀豆凝集素(ConA)亲和柱层析分离和浓集ConA结合型蛋白质，进行

3、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)和双向电泳(2-DE)分离，建立人健康肝组织ConA结合型蛋白表达谱，应用基质辅助激光解吸飞行时问串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)和数据库搜索鉴定该图谱中所有蛋白点。利用NetNC,lyc和NctOGlyc软件对鉴定的蛋白进行耱基化位点预测，应用生物信息学对这些蛋白进行QuickGO搜索．依据三个主要的G∞eOntology种类，即生物过程、分子功能和细胞内定位对它们分类分析。结果：人健康肝组织中提取的总蛋白通过ConA亲和层析柱分离为两组份，柱不结合组分由非ConA结合型糖基化蛋白构成：柱结合组份由C

4、onA结合型糖基化蛋白组成。两组份与总蛋白进行SDS．PAGE，发现通过亲和层析使得ConA结合的低丰度糖蛋白得到富集，在60KD处有一明显浓集的条带。对它们进行2-DE分离，并结台SYPRO-Ruby荧光染色技术，获得人健康肝组织ConA结合型蛋白表达谱．P【)omst7．0软件探测到蛋白质点301i15个，分析图谱发现较偏酸性端和碱性端，n3．5，MW25．47KD区域处有多个高丰度蛋白，低分子量糖蛋白亦较多；切取130个蛋白点，应用MALDI-TOF-础S／MS进行鉴定，通过数据库搜索及去冗余后，共鉴定B5种蛋白。将这些蛋白进行塘基化位点预测，

5、除5个蛋白仅具有。连接糖基化位点外，其他蛋白均含有潜在悼连接糖基化位点。应用生物信息学对这些蛋白进行分类，发现参与代谢通路及与细胞周期相关的蛋白分别占35％和22％，ConA结合型总糖虽白以定位在细胞质和细胞核中为最多。结论：(1)凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS眦S分析是相对稳定的高通量糖蛋白质组学共性技术平台。可用于大量样本的疾病蛋白质组学中蛋白质塘基化修饰谱的研究，对发现与疾病发生、发展中相关的异常糖基化蛋白质有重要价值。(2)本研究建立了人健康肝组织ConA结合型蛋白蛋白数据库，共鉴定博士研究生论文人肝脏相关ConA和DSA结

6、合型糖蛋白组学研究出85种蛋白质。它们在胞浆、胞核及胞膜上均有不同程度的分布，参于体内代谢和细胞生理过程，发挥催化和结合反应的作用。关键词ConA亲和层析人健康肝组织糖蛋白组学第二部分人肝蔓陀萝凝集素(DSA)结合型糖蛋白组学研究【摘要]目的；本部分我们利用已建立的凝集素亲和层析技术平台富集DSA结合型糖蛋白，通过双向电泳和多维色谱两种途径进行分离，利用质谱鉴定获得的糖蛋白数据来建立人健康肝组织及肝癌组织DSA结合型塘基化蛋白质数据库，为正常状态下，机体内糖蛋白的全面阐述提供基本生物学信息，为蛋白质多天线型糖链结构在体内功能研究提供理论依据。方法：通

7、过免疫荧光检测DSA结合型糖蛋白在人正常肝细胞chang’sliver中的表达和定位，从人健康肝组织及肝癌组织中提取总蛋白，通过蔓陀萝凝集素(DSA)亲和柱层析分离和浓集DSA结合型糖基化蛋白质，分别通过双向电泳、糖蛋白染色复合总蛋白染色、基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALD!．TOF．MS／MS)技术及通过二维色谱(2D-LC)、纳升级电喷雾质谱(nESI．MS)技术对于亲和层析所获得的DSA结合型糖蛋白进一步的分离和鉴定，建立人健康肝组织及肝癌组织DSA结合型糖基化蛋白数据库，并对2-DE和2D-LC两种分离方法进行比较。利用NetNGly

8、c软件对鉴定的蛋白进行糖基化位点预测，应用生物信息学对这些蛋白进行QuickGO搜索并分类分析。结果：免疫荧