2015年版中国药典控制菌微生物限度检查法-意见稿

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1、附录×××非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”（附录×××）。如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时,若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无

2、毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。培养基适用性检查和方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。金黄色葡萄球菌(S

3、taphylococcusaureus)〔CMCC（B）26003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)〔CMCC（B）10104〕大肠埃希菌(Escherichiacoli)〔CMCC（B）44102〕乙型副伤寒沙门菌(SalmonellaparatyphiB)〔CMCC（B）50094〕白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC（F）98001〕生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、

4、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨肉汤培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时。上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，稳定的孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮

5、存期内使用。阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂代替供试品进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照试验。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。培养基适用性检查控制菌检查用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基的适用性检查。控制菌检查用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。各培养基的检测项目及所用的菌株见表1。表1控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道菌增菌肉汤促生长能力

6、大肠埃希菌铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌紫红胆盐葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性大肠埃希菌铜绿假单胞菌大肠埃希菌麦康凯肉汤促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌麦康凯琼脂促生长能力+指示特性大肠埃希菌沙门菌RV沙门菌增菌肉汤促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂促生长能力+指示特性乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型副伤寒沙门菌铜绿假单胞菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂促生长能力+指示特性金黄色葡萄球菌抑制

7、能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示特性白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查取试验菌悬液（见表1）各0.1ml（含菌数50～小于1

8、00cfu）分别涂布于被检培养基和对应的对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。培养基抑制能力检查接种不少于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。培养基指示特性检查取试验菌悬