小分子化合物诱导大鼠肝干样细胞向胰腺内分泌前体细胞分化的研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壶昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：引浆夕囱签字日期：7。f二年r月冲日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论

2、文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：啪揭导师签名(手写)：剀畅签字日期：吲弓年F月叩日签字日期：Wfj年孓月叩日摘要目的：用小分子化合物在体外诱导肝干样细胞分化为胰腺内

3、分泌前体细胞，建立一种以肝干样细胞来源的胰腺内分泌前体细胞的非转基因的实验方法，为进一步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺p细胞转分化的技术体系的研究奠定基础。方法：选用5．氮杂胞苷(5-aza一2’．deoxycytidine，5-AZA)，曲古霉素A(TrichostatinA，TSA)，维甲酸(Retinoicacid，RA)，胰岛素转铁蛋]i西(Insulin，transferrinandselenite，ITS)等小分子化合物，分两步法直接诱导肝干样WB．F344细胞(WB细胞)分化为表达胰腺十二指肠同源框蛋白1(Pa

4、ncreaticandduodenalhomeoboxfactor1，PDXl)的胰腺内分泌前体细胞，用含有luM—lOuM10个不同浓度5-AZA分化培养基诱导WB分化，摸索诱导分化的最佳条件。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，用逆转录聚合酶链反应(RT—PcR)、免疫荧光和葡萄糖刺激试验对第一步诱导细胞(wB．1细胞)和胰腺内分泌前体细胞(WB—A细胞)进行鉴定。结果：1．显微镜观察：5-AZA5uM处理2d，TSA1d，约20％WB细胞由椭圆形或多边形向梭状细胞改变，此时细胞为WB一1细胞；WB一1经RA联合ITS诱导

5、7d，细胞形态类似于WB—l细胞，但核浆比例增大，此时细胞为WB．A细胞。2。WB．1细胞RT-PCR结果：WB细胞不表达胰腺相关基因，表达ALB，AFP，GLUT2等基因。WB．1细胞中未表达PDXl及其它胰腺发育相关基因，肝细胞表达基因ALB，AFP和标志肝细胞去分化的基因C／EBPfl开始下调。3．WB．A细胞定量PCR和半定量PCR结果：5一AZA浓度为5uM时，获得的WB—A细胞PDXl表达量最高，标志肝干细胞分化的基因C／EBPl3下调；WB．A表达NGN3，Neurod，NKX2．2等胰腺内分泌前体细胞相关基因

6、；Nestin持续表达，Insulinl表达上调。4．WB．A细胞免疫荧光：WB．A细胞PDXl阳性率约为5％：WB—A细胞Insulin阳性率为0．5％。n摘要5．WB．A细胞葡萄糖刺激试验：WB—A细胞对葡萄糖浓度变化无反应。结论：5-AZA，TSA，RA，ITS等小分子化合物能够诱导肝干样细胞表达PDXl，为胰腺内分泌前体细胞。为进～步建立肝干细胞高效、特异的向胰腺B细胞转分化的技术体系的研究奠定了基础。关键词：糖尿病；小分子化合物：WB细胞；诱导分化IIIAbs仃actABSTRACTObjective：Toesta

7、blishallinvitromethodofdifferentiationofpancreaticendocrineprogenitorfromWBcells，weinducedtheexpressingofpancreaticendocrineprogenitorgenePDXlwithsmallmoleculesinrathepaticstem-likecells．Thenewmethodwillbeusedfortransdifferentiationofpancreaticcellsfromhepaticstem—

8、likecells．andlaythefoundationforfurtherStudytodifferentiatetheIiverstem—likecellstopancreaticpcells．Methods：Usingsmallmoleculesas5-AZATSA，RA，andI