牛sry基因核心启动子定位及其基因功能的研究

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1、摘要摘要Sry(sex—determiningregionoftheYchromosome)基因主导哺乳动物雄性性别决定和睾丸的起始发育。转基因鼠证明Sty可以诱导XX型小鼠向雄性发育。Sty蛋白含有一段可以结合DNA的区域，被称为HMG．box。HMG．box在哺乳动物不同物种间相对保守，人SRYHMG—box区域相应位置的点突变可以引起性别反转。对人SRY的亚细胞定位研究结果表明其分布在Sertoli细胞细胞核内，推测其发挥转录因子作用。目前，Sry的表达调控机制依然不清楚。鼠Sty在XY型胚胎生殖嵴Sertoli前体细胞中表达，并受到严格的时空限制，但在其他

2、物种并不十分严格，如人、羊在成年雄性的睾丸内依然可以检测到其表达。虽然己证明Sry具有诱导睾丸发育的功能，但其下游目的基因仍然无法确定。Sox9是Sry可能的下游基因之一。st(Steroidogenicfator-1)，G口幻4(GATAbindingprotein们，WtlOZ班lms’tumorgene)、Sox9(Sry-relatedHMGbox一9)、Amh(AntiMullerianHormone)和Daxl(Dosagesensitivesexreversallocus．"也被证明在性别决定过程中有重要作用。目前关于哺乳动物Sry基因的大量研究主要

3、集中在人和鼠上，在其他动物上的研究较少。牛作为重要的经济动物，在畜牧业生产中具有重要价值，奶牛繁殖时产生的半数雄性牛，经济价值很低，目前采用的性别控制技术，主要是依据x精子和Y精子DNA含量上的微小差别，以流式细胞技术分离，存在价格昂贵，分离效率低，及所分离的精子受精率低等问题。阐明牛性别控制相关基因的调控模式，有希望在分子水平上千扰性别决定的调控网络，可以为奶牛性别控制提供新的思路；也可为哺乳动物性别分化的比较生物学研究填补牛相关数据的空白。本试验对牛Sry基因进行了结构与功能的研究，主要内容包括：克隆了牛SO,基因包含5’侧翼和编码区在内的1838bp序列；原

4、代分离培养牛生殖嵴细胞及卵巢颗粒细胞，并对生殖嵴细胞进行性别鉴定及特征鉴定；利用生物信息学方法预测牛Sty5’侧翼1066bp内潜在转录起始位点TSS及转录因子结合位点，比较10个物种SRY／Sry蛋白同源性及趋异分化程度，并进行物种进化分析，比较牛及人SRY蛋白的三维结构；构建不同长度的缺失牛Sty5’侧翼序列调控的报告基因载体，利用荧光素酶双报告基因分析系统在生殖嵴细胞内研究牛s,y核心启动子区域位置；构建了pcDNA3．1-Sry表达载体，在生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行了Sty过表达，利用半定量RT-PCR对性别控制相关基因在Sry过表达前后的表达水平变化

5、进行检测，包括St，Gata4，Wtl，Sox9，Amh和Daxl：构建pEGFP-N1．s,y亚细胞定位表达载体，其可以表达融合蛋白(Sry．GFP)，在牛生殖嵴细胞和卵巢颗粒细胞中进行了Sry亚细胞定位研究。主要结论如下：1．克隆了牛跚基因包括5’侧翼及编码区(ORF)在内的1838bp序列，通过测序及序列比对，结果和GenBank中牛so,序列(No．AB039748．1)完全一致。2．原代分离培养牛生殖嵴细胞，对其进行鉴定表明，此细胞为处于性别分化时期的雄性生殖嵴细胞，在体外生长状态良好，可以稳定传代，为后继研究奠定了基础。3．原代分离培养牛卵巢颗粒细胞，

6、经过在体外传代观察，细胞形态均一，在体外生长状态良好，可以稳定传代，为后继研究奠定了基础。VII东北农业大学农学博十学位论文4．对牛＆咖’端1066bp序列的生物信息学分析发现，分别在-93、-419、-722(ATG中A为0点)位置存在三个潜在的转录起始点(TSS)，而且这段区域含有非常丰富的转录因子结合位点信息，这和so,基因表达的特异性、复杂性相一致。5．10个物种SRY／Sry蛋白序列比较结果表明，牛和山羊SDr蛋白同源性最高，达到93．5％；牛和小鼠Sty蛋白趋异分化程度最高，达60．4％。6．进化分析表明牛与羊在亲缘关系上最为接近，归为一类，在比较的1

7、0个物种中是处于进化最远的亚类，表明偶蹄目动物so,基因在进化上受自然选择的影响有较大的变异。7．比较牛和人SRY蛋白结构，仅在保守区HMG．box处有较高的相似性，但是空间构象却比较相似，都是通过结合DNA螺旋小沟来识别7个碱基的核心靶序列，作用方式也很相似，说明虽然SRY／Sry蛋白在物种间序列差异较大，但蛋白的结构和作用方式却是很保守的。8．在生殖嵴细胞内，利用双荧光素酶报告基因检测系统，用13个缺失表达载体，对牛Sty5’侧翼1056bp启动子区域进行了细致扫描，结果表明牛so,核心启动子位于翻译起始位点ATG(A为O点)上游．599～565bp一段35b

8、p大小的区