汉黄芩素对胃癌生长及细胞免疫功能影响的研究

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1、肖炜明：汉黄芩素对胃癌生长及细胞免疫功能影响的研究1汉黄芩素对胃癌生长及细胞免疫功能影响的研究中文摘要汉黄芩素(wogonin)是半枝莲的主要活性成分之一，为一种天然黄酮类化合物，分子式为C16H1205，具有抗氧化、抗菌、抗炎、镇静和广泛的抗肿瘤活性等作用。然而，汉黄芩素抗肿瘤活性的研究多集中于体外观察其对肿瘤的细胞毒活性，体内应用汉黄芩素是否具有抗胃癌活性、以及汉黄芩素在杀伤胃癌细胞的同时，对机体树突状细胞(DC)和T／NK淋巴细胞功能的影响如何，期待深入研究。本文首先基于胃癌临床资料，观察人体胃癌组织VEGF

2、表达、血清VEGF浓度分别与局部肿瘤DCs浸润及其活性的关联；其次基于小鼠荷瘤模型，明确汉黄芩素是否具有抑制胃癌生长，以及荷瘤小鼠经汉黄芩素治疗后体内细胞免疫功能的变化；并分析汉黄芩素对生理状态及胃癌微环境中树突状细胞(DC)活性的影响及其机制；最后观察汉黄芩素直接对T细胞和NK细胞功能的影响，以及是否协同DSS诱导小鼠肠炎的发病，从而深入阐明汉黄芩素体内抗肿瘤活性的机制。研究内容分为4部分：1．胃癌组织VEGF表达及血清VEGF浓度与DC浸润及其活性的关联分析目的：分析胃癌患者肿瘤组织VEGF表达、血清VEGF浓

3、度对肿瘤组织内DCs浸润及其活性的关联，明确VEGF对DC表达CD86的影响。方法：应用免疫荧光法检测胃癌组织肿瘤细胞和CDllc+细胞VEGF的表达，酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清VEGF的浓度。分离胃癌患者和健康个体外周血单个核细胞(PBMC)，利用GM—CSF和IL．4体外诱导为DC，比较两组人群DC表面HLA．DR和CD86的表达。最后用重组VEGF蛋白体外刺激DC，观察VEGF对DC表达CD86的影响。结果：胃痛组织VEGF阳性表达率明显高于癌旁组织，VEGF表达强度与DC浸润程度呈反向关联。VE

4、GF的表达与胃癌的大小、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。CDllc+DC密度的浸润密度与淋巴结转移、TNM分期呈负相关。胃癌组织rflCDllc+VEGF+双阳性细胞频率明显高于癌旁组织。CDllc+VEGF+细胞密度与TNM分期、淋巴结转移均正相关。胃癌患者血清内VEGF浓度明显高于健康个体。与健康个体相比，胃癌患者外周血单个核细胞来源DC表面HLA．DR和CD86的表达均降低。重组VEGF下调胃癌患者DC表面CD86的表达。结论：胃癌细胞VEGF的表达强度与肿瘤组织DC浸润密度呈负相关，而胃癌患者血2

5、扬』、I'1大学博士学位论文清高浓度VEGF与其外周血单核细胞来源DC表面HLA—DR和CD86的表达降低有关，肿瘤组织分泌VEGF的DC频率与胃癌进展呈正相关。提示采取靶向抑制肿瘤细胞分泌VEGF和增强DC功能的治疗方法，可取得较好的抗肿瘤治疗效果。2．汉黄芩素抑制胃癌及免疫增强双向调节活性及初步机制目的：体外观察汉黄芩素对胃癌细胞凋亡、VEGF分泌、MHCI类相关抗原A(MICA)和B7H1表达的影响，分析汉黄芩素处理胃癌细胞后形成的凋亡小体是否易于被DC吞噬，基于小鼠移植瘤模型明确汉黄芩素体内抗胃癌生长的活性

6、及对肿瘤微环境中淋巴细胞的影响。方法：首先在SGC一7901和MFC细胞的培养体系中，分别加入不同浓度汉黄芩素9阵育12小时，流式细胞仪(FCM)检测胃癌细胞的凋亡情况。另外，用ELISA方法分别检测胃癌细胞上清液中VEGF、HMGBl的分泌，FCM检测肿瘤细胞CRT、MICA、B7H1的表达。其次分离胃癌患者外周血PMBC，诱导成未成熟DC，将汉黄芩素各组处理后的SGC．7901细胞与iDC共培养48小时，用流式细胞仪检测各组CDllc+CFSE+细胞的表达。取胃癌MFC细胞，以1×106／ml／接种于615小鼠

7、腋下成瘤。以不同剂量腹腔注射汉黄芩素，每天1次，连续3周，观察肿瘤组织生长及小鼠存活情况。最后，FCM检测小鼠移植瘤组织及脾脏中CD4+T、CD8+T、NK细胞的频率：免疫荧光法检测小鼠移植瘤组织中VEGF、RAE．1、B7H1的表达和CD4+、CD8+T、NK细胞的浸润情况。结果：汉黄芩素呈剂量依赖性诱导胃癌SGC．7901细胞和MFC细胞的凋亡，抑制胃癌SGC一7901和MFC细胞分泌VEGF，下调胃痛SGC．7901和MFC细胞表面B7H1和MICA(RAE．1)的表达。另外，汉黄芩素处理后的SGC一7901

8、细胞形成的凋亡小体易被未成熟DC吞噬。汉黄芩素体内应用抑制胃癌移植瘤生长，在50mg／kg剂量组较为明显，且50mg／kg剂量组能显著延长615小鼠的生存期；汉黄芩素治疗组的荷瘤小鼠脾脏及肿瘤组织内CD4+T、CD8+T、NK细胞的频率增高，且汉黄芩素治疗组肿瘤组织表达VEGF、RAE一1、B7Hl下降。结论：汉黄芩素不仅具有直接诱导胃癌细胞凋亡的活性，还可