沉默tak1表达对三氧化二砷作用kasumi-1细胞凋亡的研究

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1、单位代码10475学号104753101240分类号R733硕士学位论文沉默TAK1表达对三氧化二砷作用Kasumi-1细胞凋亡的研究学科、专业：肿瘤学研究方向：急性髓系白血病的靶向治疗申请学位类别：医学硕士申请人：许锦霞指导教师：魏旭东教授二〇一三年五月THEAFFECTOFTAK1GENESILENCINGONTHEAPOPTOSISOFKASUMI-1CELLSINDUCEDBYARESENICTRIOXIDEADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmen

2、toftheRequirementsfortheMaster'sDegreeofScienceByXuJinxiaSupervisor:Prof.WeiXudongApril,20134摘要第一部分CCK-8法检测As2O3作用kasumi-1细胞株细胞增殖情况目的：筛选出作用于kasumi-1细胞株的最佳As2O3浓度，为后期实验的药物作用浓度提供依据。方法：采用浓度为0µmol/L、0.5µmol/L、1µmol/L、2µmol/L、5µmol/L、10µmol/L、20µmol/L的As2O3分别作用于Kasumi-1细胞0h、2h、6h、12h、24h、48h

3、、72h。CCK-8法检测As2O3作用kasumi-1细胞后细胞的增殖情况，绘制药物作用后细胞的生长曲线，计算药物作用的IC50值。结果：As2O3作用后，细胞增殖抑制率呈浓度依赖性，和时间相关性不大，IC50值为3.5μmol/L。结论：后期实验选择As2O3作用浓度为2µmol/L。第二部分脂质体介导法转染kasumi-1细胞株转染条件的优化及siRNA筛选目的：筛选沉默效果最佳的siRNA。方法：以TAK1作为靶基因，设计出4条siRNA序列，从有无血清、转染时间、脂质体剂量、siRNA剂量四个方面优化转染效率。采用实时定量PCR和WesternBlot的方法

4、检测siRNA作用后，TAK1基因在mRNA和蛋白质水平上的变化。结果：TAK1siRNA转染kasumi-1细胞在无血清和有血清时比较，转染效率分别为(75.48±1.07）%和(61.66±0.74）%，P=0.000，差异有统计学意义；siRNA剂量为20pmol，Lipofectamine2000为1.0ul下，转染时间分别为1h、2h、4h、6h、8h、12h时，转染效率分别为（28.37±1.01）%、（47.71±0.93）%、（45.42±1.26）%、（51.68±1.28）%、（52.42±0.91）%、（33.31±1.25）%，6h和8h时，转

5、染效率比较P=0.433，差异无统计学意义。其余各组之间P＜0.007，差异有统计学意义；PCR及WesternBlot结果显示：siRNA3作用组，TAK1在mRNA和蛋白表达上最低。结论：在无血清、转染6或8小时、脂质体剂量/siRNA为20pmol/1µl时，转染效率最I高。siRNA3沉默效果最佳。第三部分封闭TAK1基因对加强三氧化二砷促kasumi-1细胞凋亡的实验研究目的：沉默TAK1表达对As2O3作用Kasumi-1细胞凋亡机制的研究方法：实验分4组，未处理组、TAK1siRNA转染组、As2O3处理组、TAK1siRNA转染联合As2O3组，流式细

6、胞学检测细胞凋亡率，甲基纤维素半固体培养计算克隆形成率，WesternBlot检测下游蛋白表达量。结果：As2O3作用kasumi-1细胞后，P-JNK表达增强，在As2O3浓度为2µmol/L，作用30min时，P-JNK表达最强。kasumi-1细胞、TAK1siRNA转染、As2O3作用、TAK1siRNA联合As2O3作用后，细胞凋亡率分别为（5.02±1.13）%、（6.18±0.28）%，（48.33±2.70）%、（86.07±2.21）%，集落形成率分别为（73.83±2.78）%、（76.03±1.46）%、（55.07±1.50）%、（22.20±

7、1.15）%，不同处理条件下凋亡率比较，kasumi-1细胞和TAk1siRNA作用比较P=0.052，其余各组比较P=0.000；不同处理条件下集落形成率比较，kasumi-1细胞和TAk1siRNA作用比较P=0.179，其余各组比较P=0.000。结论：沉默TAK1表达显著增强As2O3对Kasumi-1细胞的促凋亡作用。通过对MAPK信号通路的研究，提示在As2O3作用kasumi-1细胞的机制中，TAK1下游传导信号JNK为一负反馈传导途径。分子或药物性的靶向激酶在增强As2O3抗白血病作用上可能提供一个新途径，为开展通用型靶向药物提供一个