模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影响

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2、撰写，文责自负。研究生签名：写欢导师签章：堵之7月乞争年侈2织Ⅻ目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4研究论文模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8月lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯--17附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯19附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”26结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”29参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一29综述脐带间充质干细胞向肝细胞样细胞分化的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯33致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一46个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一47中文摘要模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质千细胞向肝细胞样细胞分化的影响摘要目的：体外条件下，采用组织块培养法分离培养人脐带间充质干细胞(humanu

4、mbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)。利用大鼠肝组织匀浆上清液(1ivertissuehomogenatesupematant，LHS)模拟肝脏组织微环境对人脐带间充质干细胞进行诱导培养，从细胞形态、肝细胞标志物甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin．18，CK．18)以及肝脏功能蛋白色氨酸2，3-力日双氧酶(tryptophan2，3-dioxygenase，TPH2)表达等方面考察人脐带间充质干细胞在肝脏组织微环境中向肝细胞定向分化的能力，以期为临床应用干细胞治疗终末期

5、肝病提供理论依据和实验基础。方法：1hUCMSCs的分离培养、表型及分化潜能鉴定无菌条件下收集足月产胎儿的脐带并储存于O．9％的无菌生理盐水中。在超净工作台内用PBS洗去脐带中残余血液并剪为3-4cm的小段。沿纵轴剖开脐带，暴露并剔除脐动脉和脐静脉，分离脐带基质即华尔通胶(wharton’Sjelly)，将其剪为O．5．1．0ram3的组织块。采用组织块培养法，加入含10％胎牛血清、100U／mL青霉素、100I_tg／mL链霉素的DMEM／F12培养基10mL；置于37。C、饱和湿度、体积分数为5％的C02的培养箱中培养。待细胞长至80．90％汇合后吸弃组织块，细胞进行

6、传代培养。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞制成单细胞悬液，采用流式细胞术检测hUCMSCs的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)标志物的表达。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，消化收集，离心重悬，以2×104个／孔的密度接种于24孔板；分别采用成骨、成脂诱导培养基进行培养，14天后分别采用VonKossa染色法检测钙化基质沉淀和油红O染色法检测脂滴。2LHS诱导hUCMSCs向肝细胞样细胞分化Sprague-Dawley(SD)大鼠，2％戊巴比妥钠按3mL／kg腹腔注射麻中文摘要醉，固定四肢，消毒皮肤。打开腹腔，分离下腔静脉和肝门静脉，结扎肝

7、门静脉远端。从肝门静脉近端进针并固定，用4"C预冷的生理盐水自肝门静脉进行肝脏灌流，待肝脏体积增大、肝叶变白时开放下腔静脉以利于灌流液排出，共灌流约30min。灌流结束后取出肝组织置于冰上，剔除被膜及韧带。称取湿重，按150mg／mL加入DMEM／F12培养基；冰浴条件下进行肝组织匀浆。4"C，15000g离心30min，取上清液，0．22}tm滤器过滤除菌，分装，．70℃冰箱储存备用。取处于对数生长期的第3代贴壁细胞，以1×105个／／111的细胞密度接种于直径为35mm塑料培养皿中，待细胞长至约80％汇合，吸弃培养基，加入