普通棉耳绒猴mhc-ⅰ型基因多态性特征分析

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文普通棉耳绒猴MHC．I型基因多态性特征分析CharacterizationofMHCclassIallelepolymorphismincommonmarmosets课题来源：国家自然科学基金(30972765)；科技部973计划项目(2009CB522507)；国家“十一五’’科技重大专项(2009ZXl0004—305)；广东省科技计划项目(20108060500010)；学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院殷森黎诚耀教授免疫学学术型硕士研究生生物技术学院

2、2013年5月7日广州硕士学位论文普通棉耳绒猴MHC—I型基因多态性特征分析硕士研究生：殷森指导教师：黎诚耀教授摘要丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)感染人体后可以引起丙型肝炎，是造成人类肝病的一个主要原因。丙型肝炎在全世界范围都有报道，国际卫生组织统计，全世界大约有1亿8千万人受到了丙型肝炎病毒的感染，并以每年新增3．5万人的速度在增加。丙型肝炎病毒具有严格的种属特异性，只有人类和黑猩猩可以被丙型肝炎病毒感染，而黑猩猩成本昂贵，加之伦理学等因素，极大的限制了丙型肝炎病毒动物感染模型的建

3、立。因此，人类一直处于一个缺乏丙型肝炎病毒动物感染模型的境地，极大的限制了开发新型抗病毒药物以及疫苗的研究。虽然科学家一直致力于丙型肝炎病毒的研究，来预防和治疗丙型肝炎持续感染，但是丙型肝炎病毒感染的分子机制一直没有被明确的阐述。GB病毒．B(GBV．B)的出现使很多研究HCV的学者开始注重另一项研究，就是开发一种GBV．B感染小型灵长类动物替代模型，来模拟HCV在人类体内感染的过程。GBV．B是一种与丙型肝炎病毒(HCV)非常相近的病毒，同属黄病毒科肝病毒属。这种病毒早在40年前被描述，它是将处在HCV感

4、染急性期的病人血清注射到绢毛猴体内，经过一段时间后，将这只绢毛猴血清继续注射到另外一只健康的绢毛猴体内，这样经历了很多次传代后，从绢毛猴体内得到的一种可以感染绢毛猴并可以引起肝炎的RNA病毒。除了绢毛猴，GBV．B还可以感染绒科动物中的普通棉耳绒猴。引起它们类似人类肝炎的症状。有一些学者还构建了HCV／GBV-B嵌合病毒，将HCV的5’-NCR、HVRl、p7等小基因片段(<212bp)，中文摘要甚至是HCV完整结构蛋白基因替换到GBV-B中，用嵌合病毒感染普通棉耳狨猴，希望能够更准确真实地模拟HCV在灵长

5、类动物体内的活动状态。普通棉耳绒猴属新世界小型灵长类动物，与绢毛猴同属绒科。普通棉耳狨猴可以被GBV．B感染并产生类似人类肝炎的症状。因此，可以用来作为一种替代模型来研究丙型肝炎病毒的感染。这种小动物具有体小(成年体重3509到4009)、繁殖率高、进食少、费用相对于黑猩猩低、易在实验室内笼养等优点。作为实验动物模型，清楚的主要组织相容性复合体多态性信息是必不可少的，尤其是I型主要组织相容性复合体与T细胞介导的免疫反应密切相关。目前我们对普通棉耳狨猴的主要组织相容性复合体多态性信息的了解却知之甚少。I型主要

6、组织相容性复合体具有高度的多态性，在T细胞介导的免疫反应中，起到了识别病原体的功能。另外，在CD8阳性的T细胞免疫反应中，对于病毒的清除存在着明显的个体差异，有些个体会自然清除，而有些个体却会持续感染，在这个现象中，个体之间存在着不同的I型主要组织相容性复合体等位基因是主要的一个因素。因此，作为实验动物，清晰的I型主要组织相容性复合体多态性背景资料是必要的。普通棉耳狨猴的种系相对来说比较单纯，很适合用来研究主要组织相容性复合体介导的T细胞免疫反应。到目前为止，对于普通棉耳狨猴I型主要组织相容性复合体的等位基

7、因的研究还很有限，只有少数几条等位基因被发现。在本研究中，从9只用来研究HCV／GBV．B绒猴感染模型的普通棉耳狨猴中分离出了I型主要组织相容性复合体全长基因并对这些基因进行了比对分析。首先，利用TRIzol将绒猴总RNA从绒猴的外周血单个核细胞中分提取出来，并妥善保存。设计并合成了两对针对绒猴I型主要组织相容性复合体的引物，这两对引物是来自文献中报道的扩增恒河猴I型主要组织相容性复合体的引物。利用RT．PCR的方法，成功的从绒猴总RNA中扩增出了全长的I型主要组织相容性复合体基因。扩增产物全长约1100b

8、p，采用了1％凝胶电泳的方法进行了鉴定，将大小正确的片段采用切胶回收的方式进行纯化后，将纯化过的扩增产物连接至PMD．T载体上，并转化至感受态细胞TOPl0，挑取单克隆，酶切鉴定后并将硕士学位论文所有的阳性克隆送往华大基因公司进行测序。利用DNAMAN5．2．2软件对序列进行比对，并将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，利用MEGA4．1软件制作系统进化树进行分析。进化树采用从Genbank中下载的其他灵长类动物的I型主