外源性硫化氢干预人脐静脉平滑肌细胞钙化机制研究

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1、分类号：R3单位代码:10752密级：公开学号:2010005宁夏医科大学硕士研究生学位论文外源性硫化氢干预人脐静脉平滑肌细胞钙化机制研究ExogenousHydrogenSulfideInterventioninHumanUmbilicalVeinSmoothMuscleCellCalcificationMechanismResearch学位申请人：昝海英指导教师：李桂忠副教授申请学位门类级别：医学专业名称：病理学与病理生理学研究方向：心血管病理生理学所在学院：基础医学院论文完成日期：二〇一三年四月宁夏医科大学研究生学院NingxiaMedicalUniversityThesisforAp

2、plicationofMaster’sDegreeExogenousHydrogenSulfideInterventioninHumanUmbilicalVeinSmoothMuscleCellCalcificationMechanismResearchStudent’sName：ZanHai-yingSupervisor：LiGui-zhongAssociateProfessorSubjectCategory:MedicalScienceMajor:PathologyandPathophysiologySpecialty:CardiovascularPathophysiologySchoo

3、l:BaseMedicalCollegeCompletionDate:Apr.2013宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复

4、印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要外源性硫化氢干预人脐静脉平滑肌细胞钙化机制研究摘要目的本实验在运用组织块重复贴壁培养原代平滑肌细胞的基础上，复制人脐静脉平滑肌细胞（humanumbilicalveinsmoothmusclecells,HUSMCs）钙化模型，探寻外源性硫化氢（hydrogensul

5、fide,H2S）供体硫氢化钠（sodiumhydrosulfide,NaHS）对HUSMCs钙化干预机制研究。方法1.原代人脐静脉组织块重复贴壁培养法以改良人脐静脉平滑肌细胞贴壁培养法为基础，将已培养组织块再次接种于新培养瓶中继续培养，用倒置显微镜观察细胞的生长，采用免疫细胞化学方法鉴定为平滑肌细胞。2.H2S对HUSMCs钙化干预及其机制研究2.1在成功复制HUSMCs钙化模型基础上，给予NaHS进行培养，实验分为6组（n=6）：对照组（10%FBS正常培养液）、钙化组（12mmol/Lβ-GP）、单纯NaHS-6-5组（8.0×10MNaHS）、钙化+NaHS高剂量组（4.0×10MN

6、aHS）、钙化+NaHS中剂-6-6量组（8.0×10MNaHS）、钙化+NaHS低剂量组（1.6×10MNaHS）。2.2检测方法①对细胞VonKossa染色、显微图像分析、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性和细胞钙含量等指标进行检测，观察各组细胞钙沉积情况。②酶联免疫吸附法检测细胞培养液中转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)的活性。③Real-TimePCR法检测细胞中TGFβ1mRNA及核心结合因子α1（corebindingfactorα1,Cbfα1）mRNA表达。I宁夏医科大学硕士研究生学位论文中文摘要

7、④Westernblot法检测HUSMCs中骨桥蛋白（osteopontin,OPN）表达。结果H2S对HUSMCs钙化的影响及其机制研究①H2S可明显减少HUSMCs钙结节的聚集生长，VonKossa染色显示细胞聚集处棕褐色钙结节较钙化组明显减轻（P＜0.05）；NaHS-低、中、高剂量组钙化细胞百分比、细胞钙含量和碱性磷酸酶活性较钙化组明显降低（P＜0.05）。②NaHS-低、中、高剂量组与钙化组相比，培