单核细胞趋化蛋白-1对人脐静脉血管平滑肌细胞增殖的影响与金雀异黄素的干预作用

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1、遵义医学院硕士研究生论文1材料1．1主要试剂改良Eagle培养基(DMEM)胎牛血清胰蛋白酶材料与方法购于Gibico公司购于华美生物工程公司为上海生物工程有限公司产品青霉素、链霉素、庆大霉素为华北制药厂产品o【．actin免疫组织化学检测试剂盒为Gene公司产品金雀异黄素(genistein)购于Sigma公司hMCP．1、PDGF购于晶美生物工程公司巯氰酸胍(Researchgrade)购于SERVA公司巯基乙醇购于AMRESCO公司s．s饱和酚购于华美生物工程公司MOPS．Rnasin购于华美生

2、物工程公司100bpladder，DEPC(焦碳酸二乙酯)购于华美生物工程公司溴乙锭，溴酚兰购于华美生物工程公司琼脂糖购于华美生物工程公司MTT购于华美生物工程公司PI为Sigma公司产品RT-PCR试剂盒为Promega公司产品其余试剂均为国产分析纯c．fos，GAPDH引物根据相应cDNA序列设计(参考文献【18．191)，由上海生物工程公司合成。引物的碱基序列及扩增片段长度，见下表l。表1PCR引物及所扩增的eDNA的长度Table1PrimersusedforPCRamplificationa

3、ndsizesofspecificeDNAGenePrimer’(57—3’)Productsizeoop)单核细胞趋化蛋白I对人脐静脉血管平滑肌细胞增殖的影响及垒雀异黄素的干预作用遵义医学院硕士研究生论文GAPDHF-TCACCATCTTCCAGGAGCGR-CTGCTrCACCACCl’r℃TTGAc．10sF-GAGATTGCCAACCTGCTGAAR-AGACGAAGGAAGACGTGt蛆572F：indicatesforward；R：indicatesreverse1．2主要仪器．C02孵箱

4、美国SHELL公司生产超净工作台(YJ．1450)苏州净化设备厂生产磁力搅拌器上海南汇电讯器材厂生产倒置显微镜日本OLYMPUS公司生产显微照相机日本OLYMPUS公司生产流式细胞仪美国BD公司生产台式冷冻离心机德国EPPENDORF公司生产7501型紫外分光光度计上海天美公司生产PCR扩增仪德国EPPENDORF公司生产凝胶成像分析仪英国SYNGENE公司生产24、96孔培养板为NalgeNunc公司产品滤器、滤膜(孔径0．22urn)购于华美公司1．3主要试剂的配制(1)PBS：A液：0．20mo

5、FL磷酸二氢钠水溶液，NaH2P04·2H2027．609溶于蒸馏水中，定容至1000ml。B液：O．20moFL磷酸氢二钠水溶液，Na2HP04·12H203．609加蒸馏水中，定容至1000ml。PH7．00的0．01mol／L磷酸盐缓冲液A液16．50ml，B液33．35ml，加NaCl8．509，溶解后定容至1000ml。(2)DMEM培养液：取一包DMEM干粉剂，溶入300ml双蒸水中，再用水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，加磁性搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌溶解，调PH至7．2，用滤膜孔径为0

6、．22um的滤器过滤，使用前按需单核细胞趋化蛋白I对人脐静脉血管平滑肌细腻增殖的髟响厦盘雀异黄素的干预作用·JO·遵义医学院硕士研究生论文加入不同量胎牛血清配成含20％、10％、I％FBS的DMEM液。(3)胎牛血清：放于56‘C水浴恒温箱中30min灭活处理，．20℃冰箱中保存。(4)D—Hanks液：称取NaCI8．09，KClO．409，Na2HP04·12H20O．139，KH2P04O．069，NaHC030．359，用双蒸水约800ml溶解后，定容至1000ml。(5)抗生素：取80万u／

7、瓶青霉素一瓶，用4ml双蒸水溶解；100万U，瓶链霉素一瓶，用5ml双蒸水溶解：在1000ml培养基中加两种抗生素各O．50ml，使其在每1000ml培养基中的终浓度均为100u／ml。(6)0．06％胰酶溶液：称0．069胰酶于烧杯中，用少量PBS调成糊状，加PBS至100ml，搅拌溶解，雹4"C冰箱过夜。过滤除菌，按每瓶5ml量分装，置一20℃冰箱保存备用。(7)PDGF：将2ugPDOF溶于20ul灭菌双蒸水中配成浓度为O．Img／ml的储备液，．20。C保存，用前按需加入培养基配成终浓度为20

8、ng／ml的应用液。(8)MCP-1：将20ugMCP-l溶于20ul灭菌双蒸水中配成浓度为lmg／ml的储备液，．20'C保存，用前加入不同量l％胎牛血清培养基配成0．1ng／ml、lng／ml、lOng／ml、100ng／ml，分别记为M1、M2、M3、M4。(9)金雀异黄素溶液：将5mg金雀异黄索粉剂用18．50ulDMSO溶解成浓度为lmol／L溶液，再分别用DMSO配成2X10"2mol／L，6×10。2mol／L，18xi0‘2mol／L储备