嗜肺军团菌ip%2fpiie+dna疫苗初步的研究

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1、四JII大学博士学位论文声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。声明人桶三簪声明人徊毛俨指导教师瓣2肪7S、"30四川大学博{：学位论文嗜肺军团菌ip／pilEDNA疫苗的初步研究病原

2、生物学专业博士研究生。扬志伟导师：陈建平教授中文摘要嗜肺军团菌是引起军团病的主要病原体，可导致流行、散在和非典型肺炎。嗜肺军团菌是一种兼性胞内寄生菌，广泛存在于各种自然水源及人工管道水源中，污染空调冷凝器、浴室、淋浴喷头等处后，人因吸入含有军团菌的气溶胶而感染，并在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖。嗜肺军团菌侵入肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞与外膜蛋白、Ⅳ型菌毛蛋白等有关。由嗜肺军团菌主要免疫原基因审编码产生的29kDa外膜蛋白(29k1)ai咖nunogenicprotein，IP)在机体防御军团菌感染方面具有重要作用，是机体免疫应答反应的主要

3、免疫原，也是军团菌致病因子，而其具体的机理仍不清楚。军团菌黏附于宿主细胞表面是其致病的先决条件，菌毛是细菌的黏附结构。嗜肺军团菌的p彳饱基因编码的Ⅳ型菌毛蛋白参与细菌多种功能活动：如黏附、活动力、特异靶细胞的识别及噬菌体的感染等。此外，29kDa外膜蛋自和Ⅳ型菌毛蛋白还是一种重要的保护性抗原。本研究在查阅分析国内外相关文献及结合本室研究进展的基础上，选择勿基因、∥饱基因为疫苗候选基因，采用重叠延伸PC,R法将嗜肺军团菌咖和口把基因融合，构建印基因、∥饱基因及ip／pilE融合四川大学博上学位论文基因的重组真核表达载体作为DNA疫苗，检测其免疫

4、原性和免疫保护性，为研制嗜肺军团菌DNA疫苗提供一定的实验依据。本研究共分六部分进行：第一部分，以嗜肺军团菌血清1型(L1)菌株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出792bp的劫基因，将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET一咖，经IPTG诱导有效表达出Trx—IP融合蛋白质。第二部分，采用PCR法从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pile基因，将其定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)，构建原核表达重组质粒pET-p，饱；并诱导Trx—PILE融合蛋白在原核系统中高效表达。第三部分，采用重叠延伸PC

5、R法将嗜肺军团菌咖和∥坩基因融合，融合基因ip／pilE被定向克隆入原核表达载体pET-32a(+)中，构建原核表达重组质粒pET-ip／pilE,经IPTG诱导表达出Trx—IP／PILE融合蛋白。第四部分，将咖基因、pilE基因和ip／pilE融合基因分别克隆入pcDNA3．1(+)中，得到真核表达重组质粒pcDNA3．卜咖、pcDNA3．1-pile和pcDNA3．卜ip／pilE．将这三种真核表达重组质粒分别用脂质体介导转染NIH3T3细胞，用免疫荧光法检测各克隆基因蛋白的瞬时表达，随后用Western-blot分别鉴定稳定转染的阳性

6、细胞，均表达出相应大小的蛋白。第五部分，将构建好的真核重组质粒作为DNA疫苗，肌肉注射免疫BALB／c小鼠两次，并设pcDNA3．1(+)、PBS组，检测免疫小鼠体内的抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、I附y、IL一2产生水平、CTL杀伤活性等指标，评价疫苗的免疫原性。结果发现，与空质粒对照组相比，各实验组均检测到不同程度的免疫原性，差异有显著性(P

7、．卜∥腰免疫组。pcDNA3．卜劫免疫组和pcDNA3．1—∥饱免疫组相比，pcDNA3．卜如的免疫原性强于pcDNA3．1-pilE．’2四川大学博+学忙论文第六部分，将构建好的真核表达重组质粒作为DNA疫苗．免疫BALB／c小鼠，加强免疫后，用10倍‰嗜肺军团菌Ll型菌株对免疫小鼠进行攻击，并设空白和阴性对照组，对照组小鼠全部死亡后，检测肺组织带茵量和肺组织病理形态学变化，评价疫苗对动物的免疫保护性。小鼠肺组织保护效率的比较发现，各实验组保护效率均明显高于pcDNA3lp)空质粒对照组，pcDNh3．卜ip／pJlE免疫组保护效率比pcD

8、NA3．卜如，pcDNA3．卜∥肥免疫组高。病理形态学检测发现：空质粒pcDNh3．1(+)免疫组主要表现为炎性病变，镜下可见肺泡隔明显增宽，局部毛细向管扩张充血，