apoe基因多态性对氟伐他汀抑制hmg-coa还原酶影响及分子机制的研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：哆辱裤签字日期：沙})年66月b汐日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文

2、被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)．／I学位论文作者签名(手写)：冯筹h导师签名(手写)：气匠—厂＼以√／签字日期：妒1、年0b月t,-／,日签字日期：讼伤年oZ月D／日摘要背景：ApoE是血浆脂

3、蛋白的重要成分，通过与LDL受体结合调节着体内的血脂水平。临床研究报道，ApoE的基因多态性对他汀类药物调节血脂的疗效有明显影响；而另有研究结果则提示阿托伐他汀调脂效应的差异似一-与ApoE基因多态性无关，孰是孰非尚需更多的研究证据予以评判。值得重视的是，ApoE与LDL受体结合参与体内脂质代谢，而他汀类药物抑制胆固醇合成的限速酶一HMG．CoA还原酶调节血脂，两条完全不同的作用途径如何产生影响和关联更加令人关注。因此，我们试图以ApoE基因多态性为切入点，运用细胞学和分子生物学的研究方式，探究ApoE的基因多态性对他汀类药物

4、调脂效应的确切影响及其分子机制，为他汀类药物调血脂作用的研究拓展新思路。目的：本课题通过比较不同基因亚型ApoE与LDL竞争性结合的差异，分析ApoE调脂效应的作用位点；采用RT-PCR检测HMG．CoA还原酶mRNA表达，比较不同基因亚型ApoE对氟伐他汀、丹参素及两者联合应用抑制HMG．CoA还原酶的影响；探讨ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG．CoA还原酶的确切影响位点及分子机制。方法：1．ApoE竞争性结合实验：建立HSF细胞模型，系统摸索LDL与LDL受体结合时间、LDL浓度等最佳实验条件；制备不同基因亚型的Ap

5、oE．DMPC复合体；建立ELISA检测方法，用来检测不同基因皿型ApoE．DMPC复合体与LDL竞争性结合而置换的LDL量。2．HMG．CoA还原酶mRNA表达实验：建立L．02细胞模型，系统摸索细胞培养血清、药物作用时间和ApoE浓度等最佳实验条件；采用RT-PCR检测L．02细胞中HMG．CoA还原酶mRNA表达量，表达量以灰度值比表示。3．通过ApoE竞争性受体结合实验，观察ApoE2(Arg112--，Cys)(突变型E2)、ApoE3(野生型E3)、ApoE4(Cysl58_A唱)(突变型E4)三种基因亚型ApoE

6、．DMPC复合体与LDL竞争性结合活性的差异。4．通过RT-PCR检测HMG．CoA还原酶mRNA表达量，考察野生型E3、摘要突变型E2、突变型E4三种基因亚型分别对氟伐他汀、丹参素、氟伐他汀与丹参素联合应用抑制HMG．CoA还原酶表达的影响；综合分析ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG．CoA还原酶影响的位点及分子机制。5．数据处理与统计分析。通过双倒数作图法计算IC50；抑制率=(空白组灰度值比一实验组灰度值比)／空白组灰度值比×100％；所有数据均以平均数4-标准差(mean+SD)表示，统计分析采用SPSS软件进行数

7、据处理，多样本组间差异采用方差齐性检验，两两比较采用独立样本t检验。统计结果以P>0．05表示差异无统计学意义，P<0．05表示有显著性差异，P<0．01表示有极显著性差异。结果：1．本研究建立的ELISA检测LDL方法灵敏度高，精密度、准确度均符合实验要求。线性范围为0．2．12．899／ml。竞争性受体结合实验的最佳结合时间为120min、LDL与受体的结合量为1．59-土：0．0799／mgprotein。LDL。在浓度范围为2-50Ltg／ml时与受体的结合量呈线性增加。2．血清培养的L．02细胞中，RT-PCR检测H

8、MG．CoA还原酶mRNA表达灰度值比为0．38+0．02，无血清诱导24h后的灰度值比上升到0．86士0．01。而氟伐他汀作用L．02细胞24h时，HMG．CoA还原酶mRNA灰度值比0．49士0．01。最适实验条件为血清培养24h。野生型E3、突变型E2、突变型E4的实验