实验手册(钱平课题组)

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1、华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病原分室实验手册(钱平课题组)-9-/9目录-9-/9实验一感受态细胞的制备一、CaCl2法制备感受态细胞主要仪器设备生物安全操作台（细菌实验用）：哈尔滨东联低温离心机：37℃温箱主要试剂0.1mol/LCaCl2：27gCaCl2.6H2O溶于1000mL双蒸水中，过滤除菌，-4℃保存备用或常温保存，使用前置于冰上预冷。LB液体培养基：LB平板:操作步骤1.用无菌接种环取冻存的菌种DH5a于LB平板上划线，同时在含氨苄青霉素（Amp）的LB平板上划线做对照，37℃温箱培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5mLLB液体培养基中

2、37℃振摇过夜。取1mL活化后的培养液加到100mLLB液体培养基中，37℃剧烈振摇培养2.5－3.0h，使OD600值达到0.5。2.在无菌条件下将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的50ml离心管中，于4℃5500rpm离心8min，弃上清，回收菌体细胞。3.用10ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2温和悬起细菌沉淀，于4℃5500rpm离心8min，弃上清，回收菌体细胞。4.用10mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2温和悬起细菌沉淀，冰浴放置30min。5.于4℃4500rpm离心10min，弃上清，用1.0mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2温和悬起细菌沉淀。6

3、.加入终浓度为15%的灭菌甘油，混匀后分装为100mL/管，直接用于转化或置于-70℃冰箱中保存备用。备注：1．CaCl2可以用0.2mm孔径的滤器过滤（最好），或者高压灭菌。2．离心管最好用新的，旧的离心管要彻底的洗干净，千万不要留有洗涤剂等残留物。3．冰浴后的细菌操作要轻。4．低温操作（保持在冰上）。-9-/9二、电转化感受态细胞的制备（PreparationofElectrocompetentE.coli(i.e.DH5а)）(Revised2/24/96)主要仪器设备：同上。主要试剂：LBmedia(1.0L)(noantibiotics!),storeatRT

4、.chilledautoclaveddH2O(1.0L),storedin4℃coldroom.chilled10%glycerol/dH2Osolution(100ml),storeat4℃.Coring250mlpointedbottles(w/orangecaps)withwhiteadapterschilledat4℃.(usinginBeckmantabletopGPRwithGH-3.7rotor,church64)Rinsebottlesfirstwith95%EtOH,thenreallywellwithdH20.Nosoap!操作步骤1.Prefera

5、bly,selectsinglecolonyofE.colifromfreshLBplateforinoculatinga10mlLBovernight(O/N)starterculture.Alternatively,streakoutfrozenglycerolstockofbacterialcellsontoLBplate,growplateO/N,andthenselectsinglecolonyforstarterculture.Grow10mlstartercultureO/Nin37℃shaker(250rpm).2.Inoculate1LofLBmedi

6、aandplaceculturein37℃shaker.GrowcellsandmeasureOD600every45min-1hr.WhentheOD600equals0.6-0.9(logphasegrowth),removethecellsfromtheshakerandplaceonice.NOTE:ITISVERYIMPORTANTTOKEEPTHECELLSAT4℃(ORONICE)FORTHEREMAINDEROFPROCEDURE.3.Splitthe1Lcultureintofourequalpartsbypouring~250mlofculturei

7、ntoeachchilled250mlCorningpointedbottle.4.Spin(#1)inGPRcentrifugeat4000rpm,15minat4℃.(IfyouchosetouseJ6/JS-4.2rotor(E.DavidsonLab),use1Lbottle,fillhalffull,spin400rpm,20minat4℃)5.Placebottlesonice.Removesupernateimmediatelyascellpelletbeginstoliftoffquickly.Gentlyresuspen