棉花课题组实验操作手册

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1、棉花基本生物技术操作手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室棉花课题组二00三年七月·武汉37目录1.MS培养基母液配制………………………………12.棉花胚性愈伤的诱导及植株再生………………23.棉花原生质体操作………………………………34.根癌农杆菌介导的遗传转化……………………65.DNA的提取和检测………………………………86.RNA的提取和检测………………………………107.分子标记……………………………………………8.分子杂交……………………………………………37前言随着本课题组科研队伍的不断壮大，科研

2、工作的全面开展和深入，各个研究方向开始交流渗透，急需一本规范的实验操作手册为课题组各个成员提供指导.手册是由本课题组多个研究方向的成员参照标准的操作程序结合自身的经验编写而成,因此具有一定的科学性和可操作性。这本手册是在张献龙教授的大力倡导和支持下完成的，课题组各个成员都积极参与了手册的编辑，在此一并致谢。金双侠编写了手册第一，二，八部分；孙玉强编写了第三部分；梁绍光编写了第四部分；朱龙付编写了第五部分；涂礼莉编写了第六部分；贺道华编写了第七部分。杨细燕负责部分文字的输入及编辑工作，涂礼莉负责全文的校对和编辑工作。

3、这本手册的编辑是本课题组第一次有益的尝试，经验不足，难免有许多纰漏，期盼课题组在今后的不断发展中能够不断改进和丰富这本手册。37MS培养基母液配制一、大量元素（20倍）母液(g/L)KNO338NH3NO333MgSO4·7H2O(无水MgSO4)7.4(3.8)KH2PO43.4CaCl2·2H2O(无水CaCl2)8.8(6.6)二、微量元素（100倍）母液(g/L)CoCl2·6H2O0.0025CuSO4·5H2O0.0025H3BO30.62KI0.083MnSO4·4H2O2.23NaMO4·2H2O0

4、.025ZnSO4·7H2O0.86三、铁盐（100倍）母液(g/L)FeSO4·7H2O2.78Na2EDTA3.73四、B5有机物VB1(硫胺素)10mg/lVB5（盐酸吡哆醇）1mg/lVB6（烟酸）1mg/l肌醇100mg/l甘氨酸2mg/l五、生长调节剂生长素（2，4-D、IBA、IAA、NAA等）细胞分裂素（KT、ZT等）母液配制注意事项：1.配制大量元素时各种药品分别称量，分别充分溶解,逐一加到容量瓶中，一定要最后加入CaCl2否则容易产生沉淀,定容到一升。2.37配制微量元素时几种极微量药品先可以配

5、成一级母液(浓缩10000倍)，再稀释成二级母液(浓缩100倍)，母液配制完毕后放置于室温下10小时以上，看是否有沉淀产生，然后才能使用。3.配制铁盐时,两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生,然后才能使用。4.各种生长激素一般可以用1摩尔/升的NaOH或HCl溶解后，再定容。5.配制B5有机物时要用无菌水来配制，一次不要配太大体积，及时用完以防污染6.各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中,发现有沉淀后，不得使用。37棉花组织培养一、无菌苗的培养将棉籽壳去掉，用0.1/100的升汞灭

6、菌十分钟，无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中配方如下：2/1MS大量元素+葡萄糖15克/l+phytagel2.5g/l，三至四天暗培养，一至二天光照培养。二、愈伤组织的诱导选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，接种于诱导培养基上配方如下：MS无机盐+B5有机物+2,4-D0.1mg/l+KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l三、非胚性愈伤组织的增殖MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+2,4-D0.05mg/l+KT0.1mg/l葡萄糖30g/l+phyt

7、agel2.5g/，或者是MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B5有机物+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l(针对那些增殖迅速的愈伤)。四、愈伤组织的分化愈伤组织经继代几次后，有的愈伤组织转成米粒状颗粒，将其转入分化培养基（MS+B5有机物+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/l+KT0.15mg/l+IBA0.5mg/l）中，进一步分化成胚状体。五、胚性愈伤组织的继代MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半)+B5有机物+IBA0.5mg/l+KT0.15mg/l+Gln(谷胺酰胺)1.0mg/l

8、+Asn(天冬酰胺)0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l六、成苗生根培养基MS无机盐(硝酸钾加倍,硝酸铵减半)+B5有机物+IBA0.5mg/l+NAA0.5mg/l+Gln1.0mg/l+Asn0.5mg/l+葡萄糖30g/l+phytagel2.5g/l七、胚性愈伤组织的悬浮培养基MS无机盐+B5有机物+Gln(谷胺酰胺)0.2