基于基因组重排技术选育优质褐色双孢蘑菇品种的研究

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1、学校代码：10264研究生学号：D120202022上海海洋大学博士学位论文题目：基于基因组重排技术选育优质褐色双孢蘑菇品种的研究StudyofBreedingQualitystrainsof英文题目：AgaricusbisporusPortobellobygenomeshuffling专业：食品科学与工程研究方向：食品生物技术姓名：王金斌指导教师：吴文惠教授二O一八年五月二十日上海海洋大学博士学位论文基于基因组重排技术选育优质褐色双孢蘑菇品种的研究摘要双孢蘑菇[Agaricusbisporus(J.E.Lange)Imbach]是世界性栽培与消费的食用菌,具有重要的经济价值和生态意义。双

2、孢蘑菇复杂的遗传生活史背景和常规育种的局限，均限制了双孢蘑菇的选育工作，导致双孢蘑菇改良菌株的研究缓慢。现在世界各国使用的双孢蘑菇商业菌种来源于品种Ｕ系列或AS2796系列的后代。双孢蘑菇工厂化栽培菌种的质量关系着双孢蘑菇产业的生存和发展。本研究通过基因组重排技术对棕秀一号进行改造，选育出产量高、品质好、适合工厂化栽培的褐色双孢蘑菇优良菌株。具体得出的结果如下：1）通过33对SSR引物对7份双孢蘑菇主栽菌株基因组DNA进行扩增，共检测出62个等位基因，不同位点等位基因数为2~4个，平均为2.48个。其中25对引物在7个双孢蘑菇基因型中存在明显多态性，占检测引物总数的75.76%。SSR引物

3、仅能将7份菌菇材料区分为四类。其中，国内褐色双孢蘑菇主栽菌株棕秀一号、LY、LC的遗传相似系数为1，与国外褐色双孢蘑菇菌株MG遗传相似系数为0.6452。国内褐色双孢蘑菇与国外褐色双孢蘑菇菌株MG遗传背景存在差异，国内褐色双孢蘑菇菌株具有相似的遗传背景。结果解释了国内褐色双孢蘑菇菌株遗传背景狭窄，多样性差，选育褐色双孢蘑菇优良栽培菌种具有非常现实的意义。2）以褐色双孢蘑菇棕秀一号为材料，利用Design-Expert8.0.6软件进行二次回归分析对参数菌龄、溶壁酶浓度、蜗牛酶浓度、酶解时间、酶解温度等进行了系统的优化研究。结果表明，用1.35%的溶壁酶和7.01%的蜗牛酶在30.4℃条件下

4、对菌龄为78.36d的菌丝体酶解3.00h，原生质体产量最高，达到4.39×10个/mL；用1.84%的溶壁酶在31.2℃条件下对菌龄为3.68d的菌丝体酶解3.38h，原生质体再生率最高，为14.1%。棕秀一号双孢蘑菇原生质体产量和再生率的优化条件的建立，为提高褐色双孢蘑菇在遗传转化、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学操作实验打下了良好的基础。3）绘制初始菌株EMS、紫外、60Co-和电子束4种诱变方法的致死率曲线，确60定EMS诱变浓度为1.25%，紫外线诱变时间为45s，Co-辐照剂量为600GY，电子II上海海洋大学博士学位论文束诱变剂量为500GY。采用4种诱变方法对起

5、始菌株棕秀一号进行诱变，通过生长速率和稳定性试验，最终得到的遗传性状稳定的生长性能改良的突变株33株，其中EMS诱变突变菌9株，紫外诱变突变菌5株，60Co-突变菌8株，电子束诱变突变菌11株。33株诱变突变库的构建为双孢蘑菇基因组重排奠定了基础。4）研究褐色双孢蘑菇不同灭活方法的致死率，优化出褐色双孢蘑菇原生质体热灭活的方法是50℃热灭活3分钟，紫外灭活的方法是紫外照射100s。优化获得褐色双孢蘑菇的递推式融合条件为PEG浓度为35%，融合体系pH为8，融合时间为30分钟，融合温度为25℃。通过4-5轮的递推式原生质体融合，筛选得到3株生长性能提高的融合株分别命名为GS4016、GS4

6、017和GS5005。从栽培料上菌丝生长、子实体原基诱导和工厂化栽培试验，融合菌株GS4016、GS4017和GS5005和棕秀一号存在明显的差异。其中重排菌株GS5005较棕秀一号在栽培料上提前了1.3天布满菌丝，形成的原基总数2提高28.66%，单位面积的产量为26.3kg/m，提高了32.83%。5）利用相关序列扩增多态性DNA分析融合菌株GS4016、GS4017和GS5005与棕秀一号进行遗传多样性分析。融合菌株与棕秀一号的成对相似系数变幅为0.5102~0.8204。其中，融合菌株4017与棕秀一号的相似系数为0.8204，融合菌株GS4016和GS5005与起始菌株棕秀一号的

7、相似系数为0.5102和0.5306。基因组重排在诱变的基础上，创造丰富了遗传变异，拓宽了棕秀一号原品种的遗传基础。6）利用高效液相色谱（HPLC）法等鉴定了不同生长阶段褐色双孢蘑菇子实体中滋味成分，结合电子舌系统对不同生长阶段褐色双孢蘑菇GS5005子实体的滋味进行差异区分，利用滋味活性值（TAV）分析了滋味成分对褐色双孢蘑菇风味的贡献率，运用主成分分析（PCA）明确了褐色双孢蘑菇生长过程中的特征性滋味成分，并对不同生