地衣芽孢杆菌T-1群体感应淬灭基因ytnP的克隆表达及其功能研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M150104138上海海洋大学硕士学位论文地衣芽孢杆菌T-1群体感应淬灭基因ytnP的题目：克隆表达及其功能研究Genecloning,expressionandfunctionofquorum英文题目：quenchinggeneytnPfromBacilluslicheniformisT-1专业：临床兽医学研究方向：水产动物医学姓名：彭孟凡指导导师：宋增福二O一八年六月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注

2、明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月

3、日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注中国水产科学研究院谢骏研究员主席淡水渔业研究中心中国水产科学研究院房文红研究员委员东海水产研究所潘连德上海海洋大学教授委员童文涛上海海洋大学研究生秘书水产与生命学院2018年5答辩地点答辩日期D楼101会议室月26日上海海洋大学硕士学位论文地衣芽孢杆菌T-1群体感应淬灭基因ytnP的克隆表达及其功能研究摘要革兰氏阴性菌在水产动物病原菌中种类最多，是水产动物主要致病性病原菌。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserinelactones,AHLs），是革兰氏阴性菌致病性应答系统中的

4、关键信号分子。当菌群中AHLs累计到一定浓度后，能激活病原菌致病基因的表达，导致病害的发生。N-酰基高丝氨酸内酯酶是一类特异性降解AHLs的金属蛋白水解酶，存在广泛，在多种微生物中均有发现。近年来，N-酰基高丝氨酸内酯酶作为群体感应淬灭策略的工具酶成为研究的热点。本研究的目的是通过对地衣芽孢杆菌（BacilluslicheniformisT-1）中的N-酰胺内酯酶基因ytnP进行克隆表达，研究其作用与功能，从群体感应抑制角度，探索水产细菌性病害的新的路径，为水产业的健康可持续发展提供技术保障。1.ytnP基因的全长克隆及生物学分析本研究自地衣芽孢杆菌T-1全基因组测序得到ytnP基因的

5、全长序列，通过PCR扩增目的基因ytnP，连接克隆载体pGEM-TEasyVector，筛选阳性克隆并进一步测序鉴定，得到ytnP的全长900bp序列；通过对ytnP的生物信息学分析发现，ytnP编码区770bp，编码256个氨基酸，分子量为29kD，等电点为5.62；含有S磷酸化位点和金属β内酰胺酶家族保守结构域H-H-DH--,--GH-H--；根据疏水性分析和跨膜信号肽预测，YtnP为酸性亲水蛋白，不具有跨膜信号区；通过蛋白质二维和三维结构预测，YtnP蛋白含有α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲结构分别占比37.11%，22.27%和40.62%，预测的YtnP的三维结构和已报道的N

6、-酰基高丝氨酸内酯酶同源性达98%，并含有同家族的活性中心。2.ytnP基因的原核表达与纯化复性本研究首先成功构建重组质粒pEASY-BluntE1-ytnP，并转入大肠杆菌，获得BL21(DE3)-pEASY-BluntE1-ytnP程菌；再通过IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside）诱导工程菌，成功表达ytnP。并优化表达条件，得到ytnP基因在0.2mM的IPTG，37℃诱导8h，蛋白的表达量最高。利用镍离子与组氨酸标签的螯合法纯化YtnP蛋白，通过优化得到洗脱条件为咪唑浓度为150mM，I上海海洋大学硕士学位论文填料体积为3mL和

7、流速为30mL/h时，蛋白质纯化为最佳，蛋白浓度达到2.17μg/μL。通过透析和谷胱甘肽氧化还原系统相结合的方法，复性包涵体YtnP蛋白，具有活性的蛋白浓度为0.81μg/μL，复性率达36.8%。以紫色杆菌野生型（ChromobacteriumViolaceumATCC12472）和突变型（C.ViolaceumCV026）为报告菌株，通过“H”划线法和牛津杯法分别成功验证了所构建的工程菌和复性蛋白的群体感应淬灭作用。并以C6-HSL信号分